邵紅霞 章 黎 楊 彬 馮 萌 付永峰 Hiroshi Tachibana 程訓(xùn)佳

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海200032)

健康人外周血B淋巴細(xì)胞具有受抗原物質(zhì)刺 激活化,分化成效應(yīng)細(xì)胞即漿細(xì)胞從而分泌相應(yīng)抗體的潛能?？贵w多樣性在免疫球蛋白的發(fā)生機(jī)制上包括了多種淋巴細(xì)胞特異的分子機(jī)制,特別是不同基因家族的重鏈V(variable)-D(Diversity)-J(joining)片段的重排與輕鏈V-J片段的重排及輕重鏈的不同組合?？贵w基因重排過(guò)程中隨機(jī)發(fā)生的體細(xì)胞突變又進(jìn)一步增加了抗體的多樣性?？贵w多樣性的分子發(fā)生機(jī)制為B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)限多樣性的免疫球蛋白基因產(chǎn)物提供了理論解釋。最新數(shù)據(jù)庫(kù)資料顯示重鏈可變區(qū)基因(VH)可分成7個(gè)基因家族,VH1～VH7,其中每個(gè)基因家族之間的同源性可達(dá)80%以上[1]。一般認(rèn)為,在健康個(gè)體,VH基因的表達(dá)常取決于各基因家族的基因片段的數(shù)量,其中VH3基因家族包括了21個(gè)功能基因片段,因而最常使用(約45.6%),而VH5、VH6及VH7家族僅有1個(gè)功能基因,因而表達(dá)頻率極低[2]。然而近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明,免疫球蛋白基因的表達(dá)不是隨機(jī)的。無(wú)論是感染某種特定病原體的患者還是健康個(gè)體,其外周血B淋巴細(xì)胞VH基因的表達(dá)均可能有偏向選擇,表明存在特定的分子機(jī)制而非僅VH基因的陽(yáng)性選擇[3]。

此外,輕鏈基因通過(guò)與重鏈基因組合的多樣性共同影響免疫球蛋白的抗原結(jié)合部位,輕鏈基因分κ和λ兩種,一般認(rèn)為在人體內(nèi)的比例約2∶1,κ輕鏈的功能基因分屬于1～5個(gè)家族,以Vκ1基因家族最多見;λ輕鏈的功能基因包括了11個(gè)基因家族,以Vλ3家族最多見。

基因工程抗體庫(kù)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的體外制備人單克隆抗體的新方法,利用抗體庫(kù)技術(shù)可以篩選到針對(duì)任何抗原分子的抗體并可進(jìn)行人工改造以提高親和力等各種生物學(xué)效應(yīng)。分析已經(jīng)建成的抗體庫(kù)基因特別是VH基因可以在一定程度上反映B淋巴細(xì)胞抗體基因的多樣性及可能存在的偏向選擇,為合理使用抗體庫(kù)制備相應(yīng)抗體及進(jìn)行后續(xù)的抗體優(yōu)化提供借鑒和參考并為外周血淋巴細(xì)胞來(lái)源的抗體基因的優(yōu)勢(shì)選擇提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。故本課題收集了300名健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞,分別獲得人免疫球蛋白的重鏈Fd和輕鏈基因,構(gòu)建天然人源IgGFab噬菌體抗體庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 淋巴細(xì)胞、載體和菌株 近2個(gè)月未患感冒等感染性疾病的健康志愿者抗凝外周血300份(每份2 ml),供血者為中國(guó)人,年齡20～40歲之間,以25～30歲年齡段居多,男女比例約1∶1。

噬菌體載體pFabICN(4.4 kb,其中酶切位點(diǎn)NheⅠ至AscⅠ為輕鏈插入位置,酶切位點(diǎn)SfiⅠ至NotⅠ為重鏈插入位置)由東海大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供[4]。測(cè)序載體CV-1和CV-2為本實(shí)驗(yàn)室自建。電轉(zhuǎn)和普通大腸埃希菌(Escherichia coli)JM109購(gòu)自大連寶生物工程(TaKaRa)公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 葡聚糖-泛影酸鈉(瑞典Pharmacia公司);總RNA提純?cè)噭┖?德國(guó)Qiagen公司);Gene Amp RNA PCR Kit,限制性內(nèi)切酶AscⅠ、NheⅠ、SfiⅠ、NotⅠ,100 bp Ladder DNA,1 kb Ladder DNA,Lambda HindⅢDNAMarker(美國(guó)New England公司);TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶λ Hind Ⅲ、DNA Ligation Kit Ver2.0(TaKaRa公司)等。

1.2 方法

1.2.1 人外周血淋巴細(xì)胞分離及總RNA提取 分批采集300份健康志愿者抗凝外周血各2 ml,分別以淋巴細(xì)胞分離液分離獲得外周血淋巴細(xì)胞后混合,以滅菌PBS洗滌后重懸細(xì)胞,共獲得約8×108個(gè)細(xì)胞,總RNA提純?cè)噭┖刑崛⊥庵苎馨图?xì)胞總RNA。

1.2.2 人免疫球蛋白Fd重鏈及輕鏈基因的擴(kuò)增 以Gene Amp RNA PCRKit進(jìn)行RT-PCR:先將淋巴細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后以一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)全部輕鏈或重鏈可變區(qū)編碼序列的特異性引物[5],對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物行PCR以分別擴(kuò)增免疫球蛋白κ、λ輕鏈和γ重鏈Fd片段。擴(kuò)增條件為:94℃2分鐘,然后94℃0.5分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共30個(gè)循環(huán),最終延長(zhǎng)為72℃7分鐘,其中72℃1分鐘步驟每個(gè)循環(huán)加1秒。PCR產(chǎn)物電泳鑒定后回收純化。

1.2.3 人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建 輕鏈基因κ、λ分別以限制性內(nèi)切酶 AscⅠ、NheⅠ酶切、純化后以κ∶λ輕鏈基因7∶1混合后與噬菌體載體pFabICN連接,連接產(chǎn)物提純后溶出于4μl蒸餾水中,分2次電轉(zhuǎn)JM109感受態(tài)細(xì)胞后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含50μl氨芐青霉素的LB平板,收集所有克隆的質(zhì)粒DNA,即為輕鏈抗體庫(kù)。

γ重鏈Fd片段基因PCR產(chǎn)物以SfiⅠ、NotⅠ酶切,純化后與輕鏈庫(kù)DNA連接,同法電轉(zhuǎn)化獲得所有克隆的質(zhì)粒DNA,即為抗體庫(kù)DNA,同時(shí)計(jì)數(shù)菌落數(shù)目以計(jì)算抗體庫(kù)效價(jià)。

1.2.4 人源IgGFab噬菌體抗體庫(kù)的鑒定及多樣性分析 抗體庫(kù)DNA分三次轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑選克隆,提取質(zhì)粒DNA,首先以λHindⅢ酶切初步鑒定,進(jìn)一步以AscⅠ、NheⅠ或SfiⅠ、NotⅠ雙酶切后鑒定輕重鏈插入片段酶切位點(diǎn)是否正確。對(duì)輕重鏈均插入正確的質(zhì)粒,以雙酶切分別獲得輕鏈、重鏈基因片段,分別與測(cè)序載體CV-2、CV-1連接,送Invitrogen(英濰捷基貿(mào)易有限公司)以ABI 3730 DNA測(cè)序儀測(cè)定核苷酸序列并推算氨基酸序列,利用IgBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)分析抗體基因的同源家族信息。

2 結(jié)果

2.1 人免疫球蛋白Fd重鏈及輕鏈基因的擴(kuò)增 來(lái)源于300份健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR,將獲得的免疫球蛋白輕鏈和γ重鏈Fd片段經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,顯示重鏈Fd基因長(zhǎng)度約為690 bp,輕鏈κ.λ基因長(zhǎng)度約為660 bp(圖1)。

圖1 重鏈和輕鏈基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of heavy and light chain genes

圖2 人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)Fig.2 Human phage-displayed Fab library

2.2 人源IgGFab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建 將所有淋巴細(xì)胞來(lái)源的輕鏈基因(κ、λ)與噬菌體載體pFabICN連接建成輕鏈庫(kù),進(jìn)一步將重鏈Fd基因片段連接于輕鏈庫(kù)DNA相應(yīng)位置中,最終獲得非依賴性克隆滴度(即庫(kù)容量)為4×108的人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)。抗體庫(kù)DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

2.3 抗體庫(kù)的鑒定和抗體基因分析 對(duì)三次隨機(jī)挑選克隆獲得的輕重鏈基因插入正確的32個(gè)克隆進(jìn)行輕重鏈基因測(cè)序,以IgBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列分析和氨基酸推算。在總共32條重鏈核苷酸序列中,其中2條重鏈基因較正常明顯縮短,另1條不屬于人免疫球蛋白基因,其余29條重鏈Fd基因片段彼此完全不同并能正確翻譯,占所測(cè)序列的90.6%。所有29條重鏈所對(duì)應(yīng)的輕鏈基因序列大小正常并能正常翻譯。

經(jīng)IgBLAST比對(duì),29條重鏈基因的V、D、J片段所屬的基因家族分布見圖3所示,其中重鏈可變區(qū)V片段中,VH3基因家族有21條,占72%,VH1基因家族3條(10.3%),VH4、VH5基因家族各 2條(各6.9%),VH7基因家族1條(3.4%)。屬于VH3基因家族的21條重鏈基因包括了3-7、3-30(各4條),3-23、3-48、3-66(各 2 條),3-9 、3-11、3-15、3-20、3-21、3-43和3-74(各1條);重鏈可變區(qū)D片段分別屬于1～6基因家族,以DH3家族最多(58.6%);重鏈可變區(qū)J片段分別屬于1～6家族,以JH4家族最多(31.0%)。29條輕鏈基因可變區(qū)V片段分別屬于Vκ1(13 條,44.8%)、Vκ2(4 條,15.4%)、Vκ3(3條,11.5%)、Vκ4(6 條 ,23.1%)基因家族和 Vλ1(3 條,11.5%)基因家族;輕鏈基因可變區(qū)J片段分別屬于Jκ1～ 2,Jκ4～ Jκ5和 Jλ3(見圖 4)。

圖3 天然人源噬菌體抗體庫(kù)中重鏈基因家族分布圖Fig.3 Distribution of heavy chain genefamilies in a na?ve human phage-displayed Fab library

圖4 天然人源噬菌體抗體庫(kù)中輕鏈基因家族分布圖Fig.4 Distribution of light chain gene families in a na?ve human phage-displayed Fab library

3 討論

抗體庫(kù)的庫(kù)容量及多樣性是衡量抗體庫(kù)質(zhì)量的重要技術(shù)指標(biāo),理論上,抗體庫(kù)容量越大,多樣性越好,篩選到針對(duì)任意抗原表位抗體的概率也就越大,親和力也可能越高。雖然由于體內(nèi)B淋巴細(xì)胞種類和數(shù)量有限,同時(shí)受克隆清除和克隆無(wú)能導(dǎo)致免疫耐受的影響,天然抗體庫(kù)的容量受限,但天然抗體庫(kù)是由經(jīng)體內(nèi)重排的抗體基因構(gòu)成,其產(chǎn)生的克隆均為有效克隆,即100%具有活性[6]。因此,對(duì)于天然抗體庫(kù)而言,廣泛的基因來(lái)源不僅有助于消除不同個(gè)體之間的差異更重要的是可以增加基因來(lái)源的多樣性,同時(shí)在建庫(kù)過(guò)程中將輕重鏈基因分別插入載體的相應(yīng)位置,有助于增加輕重鏈基因組合的多樣性,對(duì)提高抗體庫(kù)質(zhì)量意義重大。本研究以來(lái)源于300名健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞作為抗體庫(kù)基因的來(lái)源,有利于增加抗體庫(kù)基因來(lái)源的多樣性,為構(gòu)建高質(zhì)量的抗體庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。增加轉(zhuǎn)化次數(shù)是增大庫(kù)容的途徑之一,Vaughan等[7]通過(guò)上百次的電轉(zhuǎn)化獲得了1.4×1010的抗體庫(kù)。然而通過(guò)這種方式獲得的大庫(kù)容抗體庫(kù)又不可避免地影響了抗體庫(kù)的多樣性。本研究在建庫(kù)過(guò)程中努力平衡庫(kù)容量和庫(kù)多樣性兩大技術(shù)指標(biāo),從控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最佳反應(yīng)條件等細(xì)節(jié)因素著手,而不刻意以增加轉(zhuǎn)化次數(shù)等手段擴(kuò)庫(kù),構(gòu)建了庫(kù)容4×108的原始抗體庫(kù)。建庫(kù)的抗體基因來(lái)源于有活性的B淋巴細(xì)胞(相比靜息的B淋巴細(xì)胞,含有更多的mRNA),又有助于提高抗體庫(kù)基因產(chǎn)物中有功能抗體的比例[8]。

本研究對(duì)人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)中隨機(jī)獲得的29條Fd重鏈基因序列的分析顯示,重鏈VH3基因家族的表達(dá)頻率最高,VH2和VH6表達(dá)頻率最低,與Tiller等[9]的研究非常近似,該研究從 3個(gè)健康人外周血中獲得183個(gè)IgG+記憶B細(xì)胞的單克隆中提取cDNA進(jìn)行分析,VH基因家族的分布頻率為:VH1(15.8%),VH2(0%),VH3(54.8%),VH4(23.5%),VH5(6%),VH6(0%),VH7(0.7%)。王晉等[10]構(gòu)建了來(lái)源于20位健康人外周血淋巴細(xì)胞的2×108庫(kù)容的噬菌體抗體庫(kù)并從該抗體庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆46個(gè)進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)重鏈VH基因家族的分布趨勢(shì)為VH1＞VH4＞VH3＞VH6＞VH2＞VH5,其中VH3僅20%,與本研究結(jié)果差異較大。有關(guān)健康成人外周血B淋巴細(xì)胞VH基因的表達(dá)趨勢(shì),多個(gè)實(shí)驗(yàn)室曾做過(guò)相關(guān)研究,Guigou等[11]采用原位雜交方式進(jìn)行的研究表明VH基因的隨機(jī)分布方式與各基因家族中功能基因的數(shù)目相關(guān),即VH3＞VH4＞VH1＞VH5＞VH6＞VH2,但這種結(jié)果未被廣泛接受,Huang等利用二步PCR法分析B淋巴細(xì)胞庫(kù)發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體存在不同的VH基因家族的偏向性[12],Davidkova等[13]也有類似發(fā)現(xiàn),該研究運(yùn)用原位雜交的方法分析8個(gè)健康成人的外周血淋巴細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各健康個(gè)體之間VH基因家族的使用頻率存在很大差異,如VH3家族多數(shù)集中在40.4%～83.3%之間,平均達(dá)57.9%,是所有基因家族中使用頻率最高的一族,唯有一人表達(dá)僅8.5%,但其表達(dá)VH6高達(dá)76.6%,而VH6是表達(dá)頻率最低的一族,VH分布頻率總體概括為:VH3＞VH5＞VH2＞VH1＞VH4＞VH6。值得一提的是,外周血淋巴細(xì)胞VH基因的表達(dá)受到內(nèi)在基因和外在環(huán)境等多方面因素的影響,不同的體外分析手段、免疫球蛋白基因來(lái)源及個(gè)體之間均存在差異,導(dǎo)致在現(xiàn)有條件下很難對(duì)B淋巴細(xì)胞VH基因分布頻率進(jìn)行完全正確和全面的評(píng)估。現(xiàn)有多數(shù)研究結(jié)果表明,健康人免疫球蛋白基因存在VH3基因家族的優(yōu)勢(shì)表達(dá),而VH6幾乎是各家族中表達(dá)最低的一族,而對(duì)于VH1、VH2、VH4及VH5的表達(dá)情況,各研究結(jié)果之間差異較大,以VH4為例,有研究認(rèn)為僅次于VH3[9],也有數(shù)據(jù)顯示其表達(dá)頻率更低[13],本研究結(jié)果介于二者之間,即VH3＞VH1＞VH4、VH5＞VH7＞VH2、VH6。VH4基因家族優(yōu)勢(shì)表達(dá)于部分自身免疫性疾病患者,健康個(gè)體可能存在VH4的陰性選擇以避免發(fā)生自身免疫性疾病[14],這是否可用來(lái)解釋健康人存在不同的陰性選擇從而導(dǎo)致VH4基因分布頻率上的不一致性尚不明確。

本研究獲得的重鏈可變區(qū)VH片段基因分布頻率的結(jié)果與直接來(lái)源于外周血B淋巴細(xì)胞的研究結(jié)果具有較好的符合性,反映出在建庫(kù)過(guò)程中使用的一組幾乎覆蓋人IgG全部輕鏈或重聯(lián)可變區(qū)編碼序列的特異性引物確實(shí)具有較好的覆蓋性。此外,由于重鏈可變區(qū)D片段基因和J片段基因(分別屬于1～6個(gè)基因家族)分布范圍較廣,有利于V-D-J片段重排產(chǎn)生多樣性良好的重鏈基因。輕鏈可變區(qū)的V片段基因分別屬于Vκ1～4和Vλ1基因家族,以Vκ1基因家族最多見;J片段基因分別屬于Jκ1～2、Jκ4～5和Jλ3基因家族,有利于輕鏈基因V-J片段以多種排列組合方式重排。輕重鏈基因的不同組合進(jìn)一步增加了抗體的多樣性。利用抗體庫(kù)技術(shù)還可以對(duì)抗體重輕鏈可變區(qū)特別是6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)進(jìn)行定向突變,以獲得具有更好特異性和更強(qiáng)親和力的抗體,進(jìn)一步增加了抗體庫(kù)的多樣性,從而完善和補(bǔ)充現(xiàn)有的抗體庫(kù)。

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