張 潔 羅麟潔 徐麗娜 房 潔 王鴻程 (瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科,瀘州646000)

肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康與生命的惡性腫瘤之一。肺癌的發(fā)病機(jī)制還不十分明確,尚沒(méi)有靈敏、特異的診斷方法和有效的治療手段。美國(guó)著名腫瘤學(xué)家R.Peto預(yù)測(cè)如果我國(guó)吸煙和空氣污染不即時(shí)控制,到2025年我國(guó)每年肺癌將超過(guò)100萬(wàn),成為世界第一肺癌大國(guó)[1]。肺癌的發(fā)生與發(fā)展與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。STAT3是一種癌基因,有強(qiáng)烈的抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,參與了人類(lèi)惡行腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。它本身并不直接引起癌變,而是通過(guò)激活其靶基因產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)影響腫瘤的發(fā)生,STAT3的下游靶基因都與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān),如 Bcl-XL、B細(xì)胞淋巴瘤 /白血病基因-2(Bcl-2)、Mcl-1、細(xì)胞周期素 D1(Cyclin D1)、c-Myc、c-Jun、Fas、VEGF 等[2]。提示阻斷STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能起到有效的抗腫瘤作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),肺腺癌組織中存在持續(xù)性激活的STAT3。本研究擬利用RNA干擾技術(shù)阻斷STAT3激活,檢測(cè)下游分子STAT3、CyclinD1、BAX、Bcl-2 、Caspase-9 的表達(dá),觀察其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、生長(zhǎng)抑制和凋亡效應(yīng),了解STAT3作為肺癌治療新分子靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549由四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室提供;DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;Opti-MEMI為美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品 ;兔抗人 STAT3、Bcl-2、CyclinD1、BAX、Caspase-9多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自廣東中杉公司。

1.2 siRNA的制備 根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)三段STAT3特異shRNA基因序列,由廣州銳博生物公司采用化學(xué)合成法合成三條雙鏈siRNA,基因序列見(jiàn)表1。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng),分別轉(zhuǎn)染三種siRNA,即siRNA1組(sihSTAT3-1組)、siRNA2組 (sihSTAT3-2組)、siRNA3組 (sih-STAT3-3組),并設(shè)陰性對(duì)照組(Non-Control-脂質(zhì)體陰性對(duì)照組)、陽(yáng)性對(duì)照組(sih GADPH組)、空白對(duì)照組(Non-Control-血清空白對(duì)照組)、熒光對(duì)照組(Non-Control-FAM熒光對(duì)照組)及各組相對(duì)應(yīng)內(nèi)參對(duì)照組 (β-actin組)。將細(xì)胞以1×104個(gè)/0.5 ml的密度接種到24孔培養(yǎng)板,37℃孵育培養(yǎng)1～2天,使每孔的細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%。轉(zhuǎn)染前1天,使用Opti-MEMI培養(yǎng)基(使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到90%～95%的融合),分別用Opti-MEMI培養(yǎng)基稀釋FAM-siRNA和Lipofectamine2000,FAM-siRNA按1.25μl/孔的濃度稀釋,Lipofectamine2000按1μl/孔的濃度稀釋,稀釋好的Lipofectamine2000經(jīng)室溫孵育5分鐘后與稀釋好的FAM-siRNA輕輕混合,室溫放置20分鐘以形成FAM-siRNA-lipo2000復(fù)合物,將該混合物加入培養(yǎng)板中,輕晃混勻,在 37℃、5%CO2溫箱孵育,4～6小時(shí)更換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染siRNA后16小時(shí)用熒光顯微鏡觀察FAM熒光,并于轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)收集其他各組細(xì)胞備用。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞STAT3mRNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集細(xì)胞,按試劑盒說(shuō)明分別提取各組細(xì)胞的RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA,用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增STAT3。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。依據(jù)目的基因PCR產(chǎn)物與β-actin基因PCR產(chǎn)物灰度比,判斷靶基因的mRNA被siRNA沉默的程度。STAT 3-siRNAs對(duì)STAT 3mRNA表達(dá)的抑制率:抑制率(%)=(1-干擾組STAT 3mRNA相對(duì)含量/陰性對(duì)照組STAT3mRNA相對(duì)含量)×100%。PCR引物如下:STAT3 的上游引物 5′-GAGGAGGCATTCGGAAAG-3′,下游引物 5′-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3′;β-actin 上游引物 5′-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3′,下游引物5′-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3′;GAPDH 上游引物5′-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3′,下游引物 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.5 Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染STAT3siRNAs 48小時(shí)后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜。加入兔抗人STAT3抗體,孵育 1.5～2小時(shí)。TBST洗膜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體,孵育1小時(shí),TBST洗膜。熒光顯色,加入Lurriglo Keageut試劑A、B液,反應(yīng)15～30分鐘。X片曝光,拍照。

1.6 AM-BLUE法檢測(cè)細(xì)胞增殖反應(yīng) 轉(zhuǎn)染STAT3siRNAs后收集細(xì)胞,分別加入AM-BLUE試劑,孵育2～6小時(shí),收集細(xì)胞,制成密度為 1×104ml-1的細(xì)胞懸液,接種到96孔培養(yǎng)板中,分為干擾組 siRNA1 組 、siRNA2 組 、siRNA3 組 、陰性對(duì)照組 、陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組 6組,每組6個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng) 1天,待細(xì)胞貼壁,換為Opti-MEMI培養(yǎng)基培養(yǎng)1天,然后按siRNA 0.25μl/孔,Lipofectamine2000 0.25μl/孔的濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)分別向每孔加入10 μl AM-BLUE,在細(xì)胞箱孵育 2～6小時(shí)后,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè),在570nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度,參考光波長(zhǎng) 600 nm,實(shí)際的吸光度讀數(shù)=OD570 nm-OD600 nm;并計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。抑制率(%)=(空白對(duì)照組的OD值-干擾組的OD值)/空白對(duì)照組的OD值×100%。

表1 三段STAT3特異性siRNA序列Tab.1 Sequences of siRNA for STAT3 gene

1.7 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometer,FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染STAT3siRNAs后48小時(shí)收集各組細(xì)胞,PBS洗滌重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為(1×106～2×106)個(gè)/ml。加入Annexin-V-FITC和PI,避光室溫反應(yīng)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析結(jié)果計(jì)算凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。測(cè)定值以±s表示,采用單因素方差分析和Person相關(guān)分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3于A549細(xì)胞16小時(shí)后,用熒光顯微鏡觀察,可見(jiàn)FAM分散在胞質(zhì)中,說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功,見(jiàn)圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3對(duì)A549細(xì)胞STAT3基因沉默效率 轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3 24小時(shí)后,可使A549細(xì)胞STAT3表達(dá)受到抑制,較陰性組和空白組A549細(xì)胞明顯降低(見(jiàn)圖2A),但其抑制率各不相同,siRNA1、siRNA2和siRNA3的抑制率分別為(85.8±1.4)%、(88.9±1.1)%和(86.8±0.9)%,其中 siRNA2作用最為明顯(見(jiàn)圖2B),因此,選擇此序列作為目的序列進(jìn)一步研究。

2.3 轉(zhuǎn)染 siRNA-STAT3對(duì)A549細(xì)胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 干擾組與陰性對(duì)照組,干擾組與空白對(duì)照組STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平均有顯著差異。其中干擾組STAT3、CyclinD1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),干擾組細(xì)胞中BAX、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但 STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05),β-actin表達(dá)量在各組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05),見(jiàn)圖3。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(×200)Fig.1 Observed transfection efficiency under fluorescence microscope(×200)

圖2 轉(zhuǎn)染各組A549中STAT3 mRNA的表達(dá)Fig.2 STAT3 mRNA expression of cells in different group after siRNA transfection

圖3 siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染后48小時(shí) A549細(xì)胞蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression after siRNA transfection in the A549 cells

表2 STAT3基因表達(dá)對(duì) A549細(xì)胞 CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9表達(dá)影響的相關(guān)性Tab.2 The correlation between the expression of STAT3 and CyclinD1,Bcl-2,BAX and Caspase-9 in A549 cells

圖4 轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of siRNA-STAT3 on proliferation of A549 cells

2.4 轉(zhuǎn)染 siRNA-STAT3沉默STAT3基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞 CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性 siRNA2沉默A549細(xì)胞STAT3基因后,STAT3蛋白表達(dá)與CyclinD1蛋白表達(dá)及Bcl-2蛋白表達(dá)間呈正相關(guān),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),STAT3蛋白表達(dá)與Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。STAT3蛋白表達(dá)與Caspase-9蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P＞0.05),見(jiàn)表2。

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線(xiàn)圖顯示,STAT3基因沉默可以明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng),干擾組(siRNA1、siRNA2、siRNA3)分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干擾各組與陰性對(duì)照組抑制率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)圖4。

2.6 轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染后48小時(shí),siRNA1、siRNA2、siRNA3轉(zhuǎn)染組,陰性對(duì)照組,空白對(duì)照組A549細(xì)胞凋亡率分別為(67.09±11.25)%,(70.61±14.46)%,(68.91±12.16)%,(26.64±11.81)%和(21.58±12.91)%,siRNAs組的凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討論

蛋白酪氨酸激酶(Jauns激酶,JAK)可使STAT磷酸化,并激活STAT蛋白,激活前的STAT蛋白屬于胞漿蛋白,而活化后的STAT則以同源或異源二聚體形式移位到胞核,在靶基因的啟動(dòng)區(qū)與特定的DNA元件結(jié)合,發(fā)揮其生物學(xué)活性。我們前期研究中發(fā)現(xiàn),STAT3蛋白在肺癌組織中有異常高表達(dá),較正常組織顯著增高[3]。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)途徑的匯聚點(diǎn),因此,理論上講,阻斷腫瘤細(xì)胞STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路就有可能起到治療腫瘤的作用。王新華等[4]發(fā)現(xiàn),應(yīng)用小干擾RNA沉默人食管鱗癌細(xì)胞株STAT3基因,STAT3蛋白核結(jié)合活性下降,阻斷了STAT3信號(hào)的持續(xù)激活,使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期,細(xì)胞增殖受到明顯抑制。Ren等[5]發(fā)現(xiàn),在穩(wěn)定表達(dá)STAT3的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,干擾STAT3表達(dá),可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。RNAi是一種序列特異的雙鏈RNA分子。其在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過(guò)程,即siRNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA分子,從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。siRNA研究中采用的方法有化學(xué)合成法、質(zhì)粒或病毒載體法、體外轉(zhuǎn)錄法、長(zhǎng)片段雙鏈RNA切割法、PCR制備的siRNA表達(dá)框架體系等。本課題組曾成功構(gòu)建了Psuper-siRNA-STAT3重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞可有效降低STAT3mRNA水平,最大干擾效率達(dá)85.32%[6]。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)合成法得到siRNA,此種方法方便簡(jiǎn)單,易標(biāo)記siRNA以追蹤其在體內(nèi)的活動(dòng)狀況,能夠滿(mǎn)足我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA沉默A549細(xì)胞STAT3基因表達(dá)后,STAT3siRNAs能在mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低STAT3的表達(dá),對(duì)STAT3蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)73.8%,同時(shí),CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少,BAX、Caspase-9蛋白表達(dá)顯著增加;細(xì)胞增殖受到明顯抑制,凋亡率顯著增加。上述結(jié)果提示,用RNA干擾技術(shù)阻斷STAT3的表達(dá),可同時(shí)抑制多個(gè)癌基因的表達(dá),對(duì)抑制肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,抑制腫瘤生長(zhǎng)起到協(xié)同作用,為抗STAT3基因治療提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。同時(shí)提示,針對(duì)肺癌的靶向治療時(shí),單一靶向治療效果如不滿(mǎn)意,可同時(shí)聯(lián)合多個(gè)靶向治療。靶向治療將成為治療肺癌的新方向。

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3 閆凌麗,王鴻程,朱 晨.STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)活化[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009;25(2):141-142.

4 王新華,李珊珊,閻愛(ài)華 et al.小干擾RNA阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子3信號(hào)對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞株增值的抑制作用[J].中國(guó)病理學(xué)雜志,2007;36(6):379-383.

5 Ren W,Duan Y,Ji Y et al.Down-regulation of STAT3 induces apoptosis of human glioma cell:a potential method to treat brain cancer[J].Neurol Res,2008;30(3):297-301.

6 孫紹娟,王鴻程,許學(xué)亮 et al.RNA干擾技術(shù)沉默STAT3對(duì)人肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的研究[J].腫瘤防治研究,2007;34(8):565-567.