王 湛 周 玲 杜海軍 葉樹青 尉秀霞 曾 毅

非復(fù)制型腺病毒載體具有安全性高、宿主范圍廣泛、感染滴度高、易于重組基因操作、穩(wěn)定性好、產(chǎn)生的大量外源蛋白接近于翻譯后水平的成熟蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用腺病毒載體攜帶目的基因，通過表達(dá)產(chǎn)物的生物活性或通過激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答達(dá)到治療疾病的目的。非復(fù)制型腺病毒載體已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到臨床中，利用非復(fù)制型腺病毒載體表達(dá)p53基因的重組腺病毒rAd-p53已經(jīng)上市，成為世界上第一個(gè)基因治療藥物。

本研究目的是觀察攜帶EBV-LMP2基因的重組腺病毒在小鼠特內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL的時(shí)間規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 病毒、試劑

重組腺病毒Ad-LMP2本實(shí)驗(yàn)室提供；EBV-LMP2肽庫(kù)由北京中科亞光生物科技有限公司合成；ELISPOT試劑盒為荷蘭U-Cytech公司產(chǎn)品；EZ-SepTMMouse 小鼠淋巴細(xì)胞分離液由達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供；Biosys Bioreader 4000 PRO自動(dòng)讀板儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周雌性Balb/C小鼠，SPF級(jí)，共30只。中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK-（軍）2007-004）。

1.3 劑量分組

每只小鼠均免疫2×109VP Ad-LMP2重組腺病毒。

1.4 動(dòng)物免疫方法

使用1mL注射器，于小鼠脛前肌內(nèi)注射給予動(dòng)物，0.1mL/點(diǎn)，分別設(shè)0、1、2、3、4、5周，共6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組5只小鼠。為了盡量減少檢測(cè)誤差，采用不同時(shí)間點(diǎn)免疫小鼠，同一時(shí)間檢測(cè)的方案。具體方法為每周購(gòu)入5只4～6周雌性Balb/C小鼠免疫Ad-LMP2，第6周時(shí)購(gòu)入新的小鼠作為0周對(duì)照。1.5 ELISPOT分析

按照動(dòng)物免疫方案，6周時(shí)各組小鼠統(tǒng)一分類脾淋巴細(xì)胞，依小鼠IFN-γ-ELISPOT分析試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，特異刺激物為L(zhǎng)MP2混合多肽。ELISPOT板每孔中分別加入2×106細(xì)胞液100μL，100μL混合多肽刺激IFN-γ的釋放，每種多肽的使用濃度為10μg/mL，只加入100μL培養(yǎng)基不加多肽的細(xì)胞孔做自身陰性對(duì)照。37℃，5%CO2條件培養(yǎng)36h，依說明進(jìn)行斑點(diǎn)染色，ImmunoSpot計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

使用LMP2多肽刺激Ad-LMP2免疫的不同時(shí)間點(diǎn)小鼠脾淋巴細(xì)胞，ELISPOT方法檢測(cè)釋放細(xì)胞因子IFN-γ的細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞的比率。結(jié)果顯示，在免疫1周的小鼠1×106脾淋巴細(xì)胞中，可以檢測(cè)到約800個(gè)LMP2特異性釋放IFN-γ的細(xì)胞，隨著免疫后時(shí)間的延長(zhǎng)，與免疫后1周的結(jié)果相比較，免疫后2、3、4周時(shí)小鼠脾淋巴細(xì)胞中LMP2特異性釋放IFN-γ的細(xì)胞的比率沒有明顯改變，5周時(shí)略有降低，見表1和圖1。

表1 小鼠脾淋巴細(xì)胞中釋放γ-IFN細(xì)胞數(shù)（1×106脾淋巴細(xì)胞）

3 討 論

Epstein-Barr（EB）病毒屬于皰疹病毒科γ亞科，在人類廣泛傳播，為95%以上的成人所攜帶。EBV與多種人類腫瘤相關(guān)，包括鼻咽癌（NPC）等惡性腫瘤，EBV的存在為疫苗及免疫治療的研究提供了理想靶位。NPC是我國(guó)南方一些?。ㄗ灾螀^(qū)）的常見惡性腫瘤之一，與EBV健康攜帶者相比，NPC患者體內(nèi)針對(duì)EBV蛋白的CTL反應(yīng)明顯降低，在正常人、IgA/VCA抗體陽性人群、鼻咽癌病人體內(nèi)，LMP2的特異性CTL水平呈依次下降趨勢(shì)[1,2]。

圖1 Ad-LMP2免疫后不同時(shí)間小鼠脾淋巴細(xì)胞中釋放γ-IFN細(xì)胞數(shù)（1×106脾淋巴細(xì)胞，與1周時(shí)結(jié)果比較 *為P＜0.05）

介導(dǎo)腫瘤相關(guān)抗原基因轉(zhuǎn)移的方法包括病毒載體及理化方法等多種途徑。腺病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒是最常用的病毒載體，尤其是腺病毒載體目前認(rèn)為是最有前景的病毒載體。在全世界已開展的基因治療臨床試驗(yàn)中，約70%使用了病毒載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體使用最多，分別達(dá)27%和26%。由于腺病毒載體突出的安全性特點(diǎn)及比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體稍大的外源基因容量，在Ⅱ/Ⅲ期或Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，54%使用了腺病毒載體[3]。世界上第一個(gè)基因治療藥物重組腺病毒rAd-p53已經(jīng)上市，rAd-p53被用于頭頸部鱗癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌、腦瘤、支氣管肺泡癌等的臨床研究中。重組腺病毒感染細(xì)胞后，病毒基因組DNA以附加子方式存在，不整合入宿主基因組，病毒基因組不復(fù)制，但可以持續(xù)表達(dá)基因蛋白。吳丹莉等[4]利用表達(dá)綠色熒光GFP的重組腺病毒研究病毒的分布，結(jié)果表明，通過局部注射的方式免疫動(dòng)物，注射第3天時(shí)GFP熒光最強(qiáng)，第7天熒光開始減弱，第14天時(shí)消失，表達(dá)持續(xù)時(shí)間不超過3周。研究發(fā)現(xiàn)，只在注射局部檢測(cè)到重組病毒，而在肝、肺、脾、腎、腦和睪丸等部位沒有發(fā)現(xiàn)，病毒在注射局部不擴(kuò)散，沒有造成全身性分布，表明應(yīng)用重組腺病毒在治療中更加安全。

本試驗(yàn)觀察了攜帶EBV-LMP2基因的重組腺病毒在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的針對(duì)LMP2特異性CTL應(yīng)答隨時(shí)間的變化情況，為以腺病毒做載體，以提高機(jī)體相關(guān)的細(xì)胞免疫水平為目的的基因藥物的臨床免疫方案的制定提供依據(jù)。

[1]彭朝暉,張曉志.國(guó)外重組腺病毒-p53制品對(duì)腫瘤基因治療臨床研究的概況[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83(23):2098-2100.

[2]周玲,姚家偉,陳志堅(jiān),等.免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)特異性EB病毒潛伏膜蛋白2合成肽的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2000,14(4):384-385.

[3]Mo WN,Tang AZ,Zhou L,et al. Analysis of Epstein-Barr virus DNA load,EBV-LMP2 specific cytotosic T-lymphocytes and levels of CD4CD25T cells pn patients with nasopharyngeal carcinomas positive for IgA antibody to EBV viral capsid antigen[J].Chin Med J,2009,122(10):1173-1178.

[4]吳丹莉,張友榮,勞妙芬,等.腺病毒載體介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因?qū)Υ笫笮募∪毖幕蛑委焄J].科學(xué)通報(bào),2002,47(22):1726-1729.