吳燕文，辛國華，曾元臨，張道坤

周圍神經(jīng)缺損在創(chuàng)傷、電損傷中較常見，目前治療周圍神經(jīng)缺損的最有效方法仍是自體神經(jīng)移植，由于自體材料來源有限，加之取的皮神經(jīng)較細(xì)小，且易造成供區(qū)功能喪失。很多研究人員嘗試用異體神經(jīng)移植，并進行了大量實驗研究。同種異體神經(jīng)移植需要解決消除免疫性、組織保存、神經(jīng)再生效果和機能恢復(fù)、術(shù)后感染等問題。處理異體神經(jīng)的方法有很多，如低溫冷凍、凍干、凍融、血漿浸泡、輻照等方法都被實驗證實能較好的降低異體神經(jīng)的抗原性及保存，移植實驗也證實了較好的移植效果。但以上方法只有輻照能較好的降低異體神經(jīng)的抗原性同時能滅菌，阻止肝炎、艾滋病等的病原體的傳播[1]，無疑在應(yīng)用于人體移植方面更具優(yōu)勢。但經(jīng)以上方法處理的異體神經(jīng)都不具有抗菌性能，不能有效防止移植后的感染。Ag+是一種極強的無機金屬離子殺菌劑，筆者嘗試用復(fù)方銀溶液浸泡后再輻照處理同種異體神經(jīng)，并觀察移植術(shù)后宿主的免疫排斥反應(yīng)，以期為臨床治療提供一種新的良好異體神經(jīng)材料。

1 材料與方法

1.1 異體神經(jīng)的制備 取6只新鮮南昌大白兔（南昌大學(xué)實驗動物中心提供）坐骨神經(jīng)。①輻照含銀同種異體神經(jīng)組：坐骨神經(jīng)用生理鹽水沖洗干凈后，在配制好的復(fù)方銀（主要含0.5%氟哌酸和0.3%硝酸銀）溶液中浸泡12 h后取出，待溶液滴干，用濕無菌紗布包裹裝入已消毒鋁薄塑料袋中封口，送X線照射（斯科達直線加速器），照射溫度為0～5℃，放射輻照時間為 12 h，總劑量 20kGy，貯存于-30～-40℃冰箱中備用；②深低溫冷凍處理組：坐骨神經(jīng)用生理鹽水沖洗干凈后，浸在保護液（DMEM+10%甘油）中15 min，取出放入已消毒的玻璃瓶中密閉封存，置于-80℃深低溫冰箱中保存，10 d后可以使用。使用前，放入37℃恒溫水浴中復(fù)溫2 min，然后置于生理鹽水（含100 U/ml慶大霉素）中浸泡15 min。

1.2 實驗分組 將18只大白兔（南昌大學(xué)實驗動物中心提供），不分性別，體重2.0～2.5 kg，隨機分為A、B、C三組，每組6只，A組移植輻照含銀同種異體神經(jīng)，B組移植深低溫冷凍異體神經(jīng)，C組自體神經(jīng)互植。

1.3 手術(shù)方法 3%異戊巴比妥鈉腹腔（30 mg/kg）注射麻醉，大腿后部正中切口，顯露梨狀肌下緣至脛腓分叉處的坐骨神經(jīng)段，移植2 cm長輻照含銀同種異體神經(jīng)1根，以7-0線無損傷縫線行神經(jīng)束膜吻合；同樣方法暴露對側(cè)坐骨神經(jīng)，移植2 cm長輻照含銀同種異體神經(jīng)1根。B組暴露左右坐骨神經(jīng)，分別截取2 cm移植同長度深低溫冷凍異體神經(jīng)，C組暴露左右坐骨神經(jīng)，截取2 cm長的坐骨神經(jīng)后自體互植。

1.4 微量淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)試驗 ①淋巴細(xì)胞懸液制備：取健康南昌大白兔腸系膜淋巴結(jié)3個，經(jīng)NS和DMEM液沖洗血跡，用100目不銹鋼篩研磨制成單個細(xì)胞懸液，提取2 ml，加入1/2量的淋巴細(xì)胞分離液2 000×g離心15 min，用吸管將分離液面的淋巴細(xì)胞移入試管內(nèi)，再加入等量的DMEM液進行稀釋1 500×g離心15 min，用毛細(xì)胞吸管吸取少量細(xì)胞液沖入記數(shù)板內(nèi)，顯微鏡下計數(shù)，制備成5×106/ml淋巴細(xì)胞懸液，置4℃冰箱備用；②淋巴細(xì)胞毒測定：分別于術(shù)后4、8周取動脈血2 ml，注入標(biāo)記好的試管內(nèi)，待凝固后，1 000×g離心15 min，將上層血清移入試管內(nèi)，在微量多孔反應(yīng)板每空內(nèi)加入50 μl抗血清、50 μl淋巴細(xì)胞懸液，輕輕振動，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵化（37℃，45 min），冷卻后加補體（由豚鼠血清制備）100 μl，室溫下培養(yǎng) 1 h。 取 30 μl上述液體加臺盼藍10 μl染色5 min，顯微鏡下計數(shù)。每個處理組均含4個平行孔。

2 結(jié) 果

微量淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)試驗結(jié)果輻照含銀組淋巴細(xì)胞死亡率與自體組比較無顯著性差異（P＞0.05），但均低于冷凍組（P＜0.01）。 見表 1。

表1 兩組淋巴細(xì)胞死亡率（±s，%）

表1 兩組淋巴細(xì)胞死亡率（±s，%）

與 A、C 組比較，*P＜0.01

組別 術(shù)后4周 術(shù)后8周A 13.13±3.00 12.14±2.10 B 40.13±3.21* 31.21±3.23*C 11.34±3.11 10.02±2.79

3 討 論

Fawett等[2]認(rèn)為，神經(jīng)移植體需具有以下特征：①再生軸突必須能順利長入,并通過該移植體達到遠(yuǎn)端；②通過移植體的軸突必須成熟到具有正常的直徑,正常的髓鞘化和正常的傳導(dǎo)動作電位；③無抗原性；④能較快地獲得血供；⑤移植體內(nèi)再生軸突必須排列有序,以確保準(zhǔn)確地到達靶組織、靶器官。輻照方法是通過60Coγ射線照射使雪旺（Schwann）細(xì)胞受損并降解而被吞噬細(xì)胞所吞噬或排除而降低抗原性，其殘?；け槐Ａ粼谠唬@種基膜可在神經(jīng)移植中作為一種“導(dǎo)管”而助于周圍神經(jīng)的再生[3]。用輻照處理異體神經(jīng)移植后，纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤較少，再生的神經(jīng)纖維數(shù)量增多，比自體神經(jīng)移植修復(fù)效果差，但優(yōu)于未經(jīng)處理的異體神經(jīng)移植[4]。

Ag+是一種極強的無機金屬離子殺菌劑，水中銀離子濃度為0.01 mg/L時即有殺菌作用；其殺菌原理是帶陽電荷的Ag+能夠吸附住在帶有陰電荷的細(xì)菌表面，甚至向細(xì)胞內(nèi)滲透，與細(xì)菌蛋白結(jié)合使細(xì)菌蛋白沉淀，還可使細(xì)菌賴之起呼吸作用的酶催化變性，以及與細(xì)菌巰基酶等生物活性基團結(jié)合，使細(xì)菌機體結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致其迅速死亡等；Ag+已作為一種有效殺菌劑廣泛應(yīng)用于創(chuàng)面覆蓋物，應(yīng)用于殺菌，及制作無機抗菌材料等；Ag+與銅、鋅、氟等離子合用具有協(xié)同作用，殺菌作用強，并可保持較長時間殺菌；Ag+是機體內(nèi)組織成分之一，過量對人體只可產(chǎn)生銀斑，無不良反應(yīng)[5]。本實驗將兔同種異體神經(jīng)經(jīng)復(fù)方硝酸銀浸泡后再經(jīng)輻照，實驗發(fā)現(xiàn)其富含抗菌物質(zhì)（Ag+），抑菌試驗證實其對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株均具有很強的抗菌作用。

輻照含銀同種異體神經(jīng)移植后淋巴細(xì)胞毒試驗顯示淋巴細(xì)胞死亡率與自體移植組無明顯差別，與新鮮異體組差別明顯，說明對輻照含銀同種異體神經(jīng)移植無明顯排斥反應(yīng)。筆者借鑒李國輝等[6]的方法將異體神經(jīng)經(jīng)復(fù)方硝酸銀溶液浸泡、60Coγ射線照射處理制成輻照含銀同種異體神經(jīng)，方法簡單，既降低了抗原性，又具有較強的抗菌作用，符合神經(jīng)移植材料的要求，是周圍神經(jīng)缺損移植的比較理想材料。

[1]Moore TM,Gendler E.Viruses absorbed on musculoskeletal allografts are inactivated by terminal ethylene oxide disinfection.J Orthop Res,2004,22(6):1358.

[2]Fawcett JW,Keynes RJ.Muscle basal lamina:a new graft material for peripheral nerve repair.J Neurosurg,1986,65(3):354.

[3]Wang XY,Fan QY.Reginergation of nerve-ending and motor end-plate of exsomatized nerve graft following irradiation.J Forth Mil Med Uinv,2000,21(4):514.

[4]李建兵,姚建民,宋建良,等.放射輻照對異體神經(jīng)移植影響的實驗研究.浙江臨床醫(yī)學(xué),2000,2(4):222.

[5]薛廣波.實用消毒學(xué).北京:人民軍醫(yī)出版社,1986.704.

[6]李國輝,曹 勇,吳焱卿,等.輻照氟銀豬皮的實驗研究.中華整形燒傷外科雜志,1994,10(3):206.