徐國興 李 瓊 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與純化

徐國興 李 瓊 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建省眼科研究所

目的：探討人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離和選擇性培養(yǎng)方法。方法：將人視網(wǎng)膜通過剪碎、勻漿、過篩、膠原酶消化處理后，結(jié)合密度梯度離心和物理刮除等分離方法獲得較純的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，并采用含內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和肝素的培養(yǎng)基促進內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長，觀察細(xì)胞生長狀況，并應(yīng)用免疫組化方法進行鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞成典型的鋪路石樣生長，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色為陽性，細(xì)胞純度達(dá)98%以上。結(jié)論：本實驗方法簡單易行，培養(yǎng)出的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞純度高、生長狀態(tài)良好，并可穩(wěn)定傳代，為視網(wǎng)膜血管疾病的基礎(chǔ)研究提供有效的模型建立方法。

視網(wǎng)膜 微血管 內(nèi)皮細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病均與視網(wǎng)膜血管病理性改變密切相關(guān)。隨著對視網(wǎng)膜血管性疾病的研究深入，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞是視網(wǎng)膜血管病變過程中的關(guān)鍵細(xì)胞。通過體外分離培養(yǎng)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞獲得大量完整、純度高的內(nèi)皮細(xì)胞，從而對其進行形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能和病理變化等方面的觀察，為視網(wǎng)膜血管性疾病研究提供體外模型。本實驗以人視網(wǎng)膜為材料，探索簡便、有效的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與純化方法?，F(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料

0.1%Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）、胎牛血清(Gibco公司，美國) 、DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶（Gibco公司，美國）、纖維連接蛋白（Sigma公司，美國）、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子ECGF(Sigma公司，美國) 、Percoll分離液（Gibco公司，美國）、肝素（Sigma公司，美國）、PBS（Sigma公司，美國）、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、眼科器械、勻漿器、吸管、離心管、細(xì)胞篩、第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），完全培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液+15%FBS+90μg/mL肝素+0.1μg/L的ECGF，培養(yǎng)瓶：培養(yǎng)前1天用10μg/cm2纖維連接蛋白包被。

1.2 方法

1.2.1人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)使用的眼球為角膜移植后殘留的供體眼球。無菌操作，浸入酒精中消毒2遍，轉(zhuǎn)入DMEM培養(yǎng)液中。距角膜緣后3mm穿刺，剪去眼前節(jié)，娩出玻璃體，吸取DMEM培養(yǎng)液將視網(wǎng)膜神經(jīng)層吹起吸出，將視網(wǎng)膜置于DMEM培養(yǎng)液中洗滌2~3次，去除色素組織并夾出較大的血管，再將視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中剪碎后勻漿，將勻漿液過兩層細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)篩（先過220μm，后過86μm），將第2層細(xì)胞篩翻轉(zhuǎn)后用DMEM培養(yǎng)液充分沖洗，收集洗脫液后離心（1000r/min，10min），棄上清后加入3倍體積的0.1%膠原酶吹打均勻后移入離心管中在37℃200r/min搖床上消化60min，離心（1000r/min，10min），棄上清，用DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將Percoll分離液加入DMEM培養(yǎng)液中，以20000r/min離心30min制備連續(xù)密度梯度，吸取上述細(xì)胞懸液2mL小心加入25mL離心管頂層分離介質(zhì)面上，離心（1000r/min，10min），用注射器針頭吸取所需的細(xì)胞層(第2層)，以添加ECGF的完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于包被有10μg/cm2纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。24 h內(nèi)嚴(yán)禁移動培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)2d后首次換液，以后每2d換液1次，2天換液1次，保持ECGF的濃度。換液前相差倒置顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，標(biāo)記雜細(xì)胞位置，用細(xì)胞刮去除雜細(xì)胞。

1.2.2人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代細(xì)胞融合80％以上后，開始傳代培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗1～2次；加入0.25%胰蛋白酶與0.02 EDTA混合消化液，室溫下消化，在相差顯微鏡下觀察，當(dāng)鋪路石樣細(xì)胞開始變圓收縮，細(xì)胞間隙變大時，倒出消化液；以含15%FBS的完全培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打瓶壁上細(xì)胞，脫壁后形成細(xì)胞懸液，按1：2的比例進行傳代，接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中。傳代后每2～3 d換液1次。

1.2.3人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定

(1)形態(tài)學(xué)：在相差倒置顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)特征、生長特性及與微血管碎片的距離，并運用目鏡網(wǎng)格器計數(shù)法觀察記錄培養(yǎng)瓶中混雜的其他細(xì)胞，每瓶選擇3個視野，實驗各重復(fù)3次。(2)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢查：以0.5×105/·L 的細(xì)胞密度接種2mL細(xì)胞懸液接種于預(yù)先置有20mm×20mm蓋玻片的六孔板中，并置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h至細(xì)胞爬滿玻片后取出，PBS漂洗細(xì)胞2次，以4%多聚甲醛固定20min；PBS沖洗3次，免疫細(xì)胞化學(xué)染色二步法檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原。陰性對照：一抗用PBS代替。顯微鏡下觀察、采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點

經(jīng)過分離純化后接種于培養(yǎng)瓶的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮中混雜有許多雜細(xì)胞，如紅細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞等。24h后可見有血管內(nèi)皮細(xì)胞貼壁，呈扁平梭形；5~7d細(xì)胞分裂、克隆樣生長，形成細(xì)胞集落，呈類圓形、多邊形形狀；12d左右細(xì)胞融合呈鋪路石樣，單層生長，鋪滿瓶底，可見接觸抑制現(xiàn)象。

2.2 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體染色，即胞漿中有棕色著色，98%以上細(xì)胞呈陽性染色。陰性對照組無著色。

3 討論

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)在認(rèn)識視網(wǎng)膜血管性疾病的病理生理等過程中發(fā)揮了重要作用。視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮的培養(yǎng)由于取材困難，培養(yǎng)的細(xì)胞不易純化，一直是視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)中的難點。

3.1 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離

取材過程中，要采用新鮮的人眼，并保證操作過程絕對無菌，盡量去除視網(wǎng)膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，并夾除可見的大血管。視網(wǎng)膜微血管段的分離和內(nèi)皮細(xì)胞的獲取、純化作為視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵步驟，對微血管段的分離程度要求較高，因此我們采用剪碎勻漿分離法獲得視網(wǎng)膜微血管段。在勻漿器的選擇上，注意玻璃杵與管壁應(yīng)有一定的間隙，勻漿物與勻漿液的比例控制在1:1左右，研磨次數(shù)不宜太多，以免微血管段過度破碎。將組織分離后得到的勻漿液進行過濾和離心。用220μm及86μm的細(xì)胞篩可分別篩去未分離的血管段組織和一些較大的細(xì)胞以及血細(xì)胞等比血管內(nèi)皮細(xì)胞小的細(xì)胞及一些碎片，得到較為純凈的微血管段。我們采用0.1g/L膠原酶在37℃200r/min搖床上消化60min，能夠?qū)⒁暰W(wǎng)膜間質(zhì)消化獲得單細(xì)胞懸液并保持較好的細(xì)胞活性。

3.2 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁和純化

我們使用纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶能夠有效地促進內(nèi)皮細(xì)胞貼壁，同時抑制其他混雜細(xì)胞貼壁生長[1]。在培養(yǎng)液的選擇上，我們配制了添加有15%FBS、90μg/ml肝素、0.1μg/L ECGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，形成只利于內(nèi)皮細(xì)胞生長的選擇性培養(yǎng)環(huán)境，使內(nèi)皮細(xì)胞進一步得到純化[2]。周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的分離是純化技術(shù)的難點，我們采用密度梯度離心和物理刮除等方法去除周細(xì)胞。Percol1分離液是一種外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅膠顆粒，它無毒、無刺激性，對細(xì)胞無吸附作用，產(chǎn)生的滲透壓很小，因此在全部密度范圍保持等張。Percoll在離心過程中會自然形成密度梯度，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞因其密度不同而在分離液中處于不同的層面。從而將提高內(nèi)皮細(xì)胞純度[3]。原代培養(yǎng)3~5d后，一些混雜的細(xì)胞常常分區(qū)成片的生長，可以利用內(nèi)皮細(xì)胞呈獨特的鋪路石樣形態(tài)單層生長，而周細(xì)胞呈長梭狀的可重疊生長，在培養(yǎng)瓶底部標(biāo)記后用細(xì)胞刮匙刮除雜細(xì)胞，從而獲得較純的內(nèi)皮細(xì)胞[4]。此外，在傳代過程中，采用含0.02%EDTA的0.25%胰酶可使周細(xì)胞較內(nèi)皮細(xì)胞更先松動，利用該特點可以除去部分周細(xì)胞。

綜上所述，我們認(rèn)為使用纖維連接蛋白包被培養(yǎng)瓶及添加肝素和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基，并結(jié)合物理刮除、密度梯度離心法等可以成功獲得高純度的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，為體外研究視網(wǎng)膜血管相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)。

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1.國家衛(wèi)生部科研基金課題（基金編號：WKJ2008-2-61）；2.福建醫(yī)科大學(xué)教授發(fā)展基金課題(基金編號：2006-js033);3.國家十一五重大科研項目(基金編號：2006BAHO2A25)。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。