馮春利，　任　清，　宋煥祿

(北京工商大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 北京　100048)

γ-癸內(nèi)酯(γ-decalactone, GDL)是一種含有五元內(nèi)酯環(huán)的十碳化合物，分子式為C10H18O2，分子量為170.25[1]，結(jié)構(gòu)式如圖1.

圖1　γ-癸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structural formula of γ-decalactone

γ-癸內(nèi)酯天然存在于桃子、草莓、椰子、芒果、杏、啤酒、朗姆酒中，也存在于乳制品的風(fēng)味物質(zhì)中，已在120多種食物的香氣成分中發(fā)現(xiàn)了這種化合物. γ-癸內(nèi)酯具有強(qiáng)烈的果香和奶油香氣，稀釋時(shí)有桃子香氣[2]. 1969年，γ-癸內(nèi)酯被美國食品藥品管理局認(rèn)定為安全的食品和藥品添加劑[3]，我國GB2760—86規(guī)定其為允許使用的食用香料. γ-癸內(nèi)酯以其具有的誘人香氣和低香氣閾值(水中為0.08 mg/kg)等特性，在香料工業(yè)界得到廣泛應(yīng)用[4].

1　微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然γ-癸內(nèi)酯的機(jī)理

早在20世紀(jì)60年代，Wache等[5]在研究多種微生物的羥基酸代謝產(chǎn)物時(shí)就發(fā)現(xiàn)，某些微生物具有產(chǎn)生內(nèi)酯的能力. 此后，生物技術(shù)學(xué)家就致力于選育高產(chǎn)內(nèi)酯菌株. 目前，生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯普遍采用的是生物轉(zhuǎn)化的方法[6],雖然其機(jī)理尚未完全確定，但人們通常認(rèn)為，菌體生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的前體物質(zhì)為18個(gè)碳的不飽和羥基脂肪酸，通過β-氧化縮短碳鏈，經(jīng)內(nèi)酯化形成γ-癸內(nèi)酯. 如解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)，以蓖麻油中的主要成分蓖麻油酸(12-羥基-9-十八碳烯酸，在蓖麻油中的含量在80%以上)(如圖2)為底物，經(jīng)4次β-氧化使碳鏈縮短，再內(nèi)酯化生成γ-癸內(nèi)酯. 生物轉(zhuǎn)化蓖麻油酸產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的機(jī)理如圖3[7].

圖2　蓖麻油酸(12-羥基-9-十八碳烯酸)結(jié)構(gòu)式Fig.2　Structural formula of ricinoleic acid(12-hydroxy-9-octadecenoic acid)

圖3　生物轉(zhuǎn)化蓖麻油酸生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯機(jī)理Fig.3　Mechanism of production of γ-decalactone from castor oil acid by biotransformation

2　對發(fā)酵生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的Yarrowia lipolytica進(jìn)行的基礎(chǔ)性研究

目前一般選用以下菌種發(fā)酵產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯：Yarrowialipolytica[8-11]，Sporobolomycesodorus[12-13]，Sporidiobolussalmonicolor[14-15]，Sporidiobolusspp[16-18]，Candidasorbophila，Sporidiobolusruinenii[19]，Pichiaguilliermondi[20]，Candidatropicalis.

大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酵母Yarrowialipolytica非常適應(yīng)疏水環(huán)境，在眾多的可以產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的菌株中，酵母Yarrowialipolytica的能力是較強(qiáng)的[21]. 蘇暢等[22]對SporidiobolusruineniiAs2.1577、SporidiobolussalomonicolorAs2.1482、As2.1550、As2.1574、As2.1603、YarrowialipolyticaAs2.1405、As2.1552這7株菌產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的能力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YarrowialipolyticaAs2.1405產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的能力最強(qiáng)，產(chǎn)率為1%.

王勇志等[23]也比較了YarrowialipolyticaAs2.1405、SporidiobolusruineniiAs2.1577、SporidiobolussalmonicolorAs2.1482、SporidiobolusodorusAs2.1574等4株菌的產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯能力，結(jié)果表明，YarrowialipolyticaAs2.1405在4株菌中產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯能力最強(qiáng)，可達(dá)到210 mg/L，而其他3株菌產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯能力相對較弱，只有YarrowialipolyticaAs2. 1405的1/10～1/4.

閆淑芳等[24]系統(tǒng)地對酵母Yarrowiasp.培養(yǎng)條件中蓖麻油添加時(shí)間、溶氧等因素進(jìn)行了研究. 趙征等[25]對不同氮源、碳源、種齡、接種量、通氣量、pH值、表面活性劑、溫度、鹽離子濃度對發(fā)酵的影響進(jìn)行了研究，并確定了最適培養(yǎng)條件. Kalyani等[26]在2000年報(bào)道，通過改變發(fā)酵條件，經(jīng)過96 h和48 h的表面和深層發(fā)酵可以分別獲得455 mg/L和167 mg/L的γ-癸內(nèi)酯.

3　Yarrowia lipolytica產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯相關(guān)基因的功能研究

過氧化物酶體β-氧化是在酵母將羥基脂肪酸轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯這一生物轉(zhuǎn)化過程中起重要作用的反應(yīng)[11,27-28]. β-氧化是一個(gè)脂肪酸循環(huán)氧化的過程，包括3個(gè)酶參與的4步反應(yīng)，代謝機(jī)理如圖4[29]. 由圖4可知，?；?CoA氧化酶(Acyl-CoA oxidase)、3-酮酰-CoA硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)、雙功能酶(bifunctional enzyme)是過氧物酶體β-氧化反應(yīng)過程的3個(gè)很重要的酶，其中?；?CoA氧化酶(Acyl-CoA oxidase)是β-氧化反應(yīng)過程中的第一步催化酶，被普遍認(rèn)為是限速酶，其活力高低與γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量有直接關(guān)系[30-31].

圖4　過氧物酶體β-氧化反應(yīng)及涉及到的酶Fig.4　Enzymes involved in peroxisomal β-oxidation reactions

Yarrowialipolytica中?；?CoA氧化酶有5個(gè)同工酶Aox1-Aox5，分別由POX1-POX5基因編碼[32]. Wache等[10]通過敲除其中一個(gè)或同時(shí)敲除數(shù)個(gè)POX1-POX5基因，初步研究了5個(gè)基因表達(dá)的同工酶對產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的影響，如圖5. 研究發(fā)現(xiàn)，長鏈特異性酰基-CoA氧化酶Aox2能夠特異性地催化蓖麻油酸生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯，而短鏈特異性?；?CoA氧化酶Aox3的存在會使γ-癸內(nèi)酯進(jìn)一步降解，因此改善Yarrowialipolytica酵母產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的量就圍繞著POX3基因進(jìn)行. Groguenin、Wache[10,33]等人在敲除掉POX3基因后，菌株γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量提高了4.4倍. 從他們的研究中得知，短鏈特異性?；?CoA氧化酶Aox3的活性還可能受到其他3個(gè)同工酶Aox1, Aox4, Aox5的影響.

圖5　同工酶Aox1-Aox5對生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的作用Fig.5　Role of isozyme Aox1-Aox5 on the γ-decalactone production

通過對POXs基因的敲除，Wache等[8,10,33]發(fā)現(xiàn)，鑒定其他3個(gè)同工酶(Aox1, Aox4, Aox5)的活性是很不容易的：POX1基因在敲除后幾乎沒有看到?；?CoA氧化酶的活性有所改變，推測POX1基因?qū)χ辨滜；?CoA無活性.POX5基因的破壞使得蓖麻油酸(C18)第一步降解受到了影響. 然而，POX4基因在敲除后沒有發(fā)現(xiàn)對γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量有大的影響.

為了確認(rèn)這5個(gè)同工酶的活性或非活性，Groguenin、Wache等[10,33]同時(shí)敲除掉POX2,POX3,POX5(ΔPOX2、ΔPOX3、ΔPOX5)基因，并且對POX2基因進(jìn)行多表達(dá). 由于POX2基因的多倍復(fù)制的表達(dá)效率非常低，從而導(dǎo)致菌體生長受到了嚴(yán)重影響，雖然γ-癸內(nèi)酯沒有進(jìn)一步降解，但是γ-癸內(nèi)酯最終產(chǎn)量非常低. 這些結(jié)果的產(chǎn)生是由于缺乏了短鏈特異性?；?CoA氧化酶Aox3的活性或者是由于降解的比率比生產(chǎn)的比率更低?這一問題至今仍然無法確知.

Nicaud等[34]認(rèn)為，由于菌體在轉(zhuǎn)化蓖麻油酸為γ-癸內(nèi)酯的過程中仍然生長，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化率的低下. 為證實(shí)此種解釋，他們篩選出一株尿嘧啶缺陷型菌株，該營養(yǎng)缺陷型菌株在不含有尿嘧啶的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化蓖麻油酸甲酯，菌體生長受到了抑制，轉(zhuǎn)化率比原菌株提高了10～20倍.

4　本研究組對構(gòu)建高產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的Yarrowia lipolytica的研究情況

4.1　通過對URA3基因的敲除提高γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量

為了構(gòu)建高產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的營養(yǎng)缺陷型Yarrowialipolytica酵母菌. 首先利用基因同源重組的方法敲除掉尿嘧啶合成酶關(guān)鍵基因URA3基因，用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD-URA)添加一定濃度的5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶篩選獲得轉(zhuǎn)化子. 得到的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，在不含有尿嘧啶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，能夠抑制蓖麻油酸的一個(gè)旁路代謝途徑和細(xì)胞生長，使其轉(zhuǎn)回內(nèi)酯的合成途徑，從而提高香味物質(zhì)γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量[34].

4.1.1尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)基劃線驗(yàn)證和分子生物學(xué)鑒定

提取營養(yǎng)缺陷型酵母基因組和野生型酵母基因組，用URA3基因上下游引物對其分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在含有尿嘧啶20 μg/mL和5-FOA為1 mg/mL的(SD-URA)固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6、圖7。

圖6　營養(yǎng)缺陷型菌株的分子生物學(xué)驗(yàn)證Fig.6　Genetic defects in molecular biology-based authentication

圖7　尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定Fig.7　Identification of Uracil auxotrophic strain

由圖6可知，營養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行URA3基因PCR擴(kuò)增得到849 bp片段，而野生型菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段仍為2 560 bp. 圖7左側(cè)為野生型菌株，未生長，而右側(cè)為獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株. 由此雙重驗(yàn)證了基因敲除成功，構(gòu)建出了尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株.

4.1.2原始菌株和缺陷型菌株的γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量分析

出發(fā)菌株(缺陷型菌株和野生型菌株)生產(chǎn)采用搖床發(fā)酵，每隔8 h取樣對其γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量進(jìn)行檢測，其產(chǎn)量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系曲線見圖8.

圖8　野生型菌株和缺陷型菌株γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵生產(chǎn)曲線Fig.8　Yield curve of γ-decalatone for wide-type and　uracil auxotrophic strain

從圖8可以看出，野生型菌株和缺陷型菌株γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量隨著菌數(shù)增長而不斷變化，缺陷型菌株γ-癸內(nèi)酯的生產(chǎn)趨勢和原始菌株的比較接近，但產(chǎn)量比原始菌體高出4.1倍，達(dá)到了1 032.9 mg/L.

4.2　敲除解酯耶氏酵母POX3基因提高γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量

利用酵母本身的銅抗性基因CRF1作為篩選標(biāo)記，敲除掉影響γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量的關(guān)鍵基因POX3基因. 通過對轉(zhuǎn)化子和野生型酵母菌目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而驗(yàn)證得到了敲除POX3基因的工業(yè)生產(chǎn)菌株.

4.2.1敲除POX3基因菌株(TA1)的分子生物學(xué)鑒定

分別提取轉(zhuǎn)化子TA1和野生型酵母基因組，用POX3基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 如圖9所示，1，2道為野生型POX3-PCR; 3,4道為轉(zhuǎn)化子POX3-PCR, 轉(zhuǎn)化子不僅提高了銅抗性，而且POX3基因片段由1.97 k長度變?yōu)?.4 k長度，故POX3基因成功敲除.

圖9　轉(zhuǎn)化子TA1和野生型酵母的POX3-PCRFig.9　PCR verification of recombinant strain and wild type

4.2.2原始菌株和POX3基因敲除菌株(TA1)產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯量的分析

出發(fā)菌株(轉(zhuǎn)化子和野生型菌株)采用搖床發(fā)酵，每隔8 h取樣對其γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量進(jìn)行檢測，其產(chǎn)量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系曲線如圖10.

圖10　野生型和POX3基因敲除轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量曲線Fig.10　Yield curve of γ-decalatone for wide-type and　mutant strain TA1

野生型和TA1分別在57,63 h左右達(dá)到γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量最大值，野生型γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量最大為0.194 g/L,而敲除掉POX3基因后的轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯最大值達(dá)到了0.531 g/L.

5　結(jié)論與展望

目前，國外對產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯Yarrowialipolytica酵母菌的研究集中于POX1-POX5基因功能研究方面，且取得了較大進(jìn)展，國內(nèi)則主要集中在優(yōu)化菌種的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)環(huán)境(pH值和溶氧量)等基礎(chǔ)研究上. 本實(shí)驗(yàn)室的研究目標(biāo)更加明確，即敲除影響產(chǎn)量的短鏈特異性酶基因POX3, 構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型菌株，在提高產(chǎn)量的同時(shí)還可作為遺傳篩選標(biāo)記，從而為基因改良的進(jìn)一步研究打好基礎(chǔ).

在下一步工作中，可以對5個(gè)同工酶基因的POX3和POX4基因進(jìn)行敲除，同時(shí)構(gòu)建POX2基因的單表達(dá)甚至多表達(dá)，從而獲得更高產(chǎn)量的γ-癸內(nèi)酯，可以將基因改造后的菌株進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)，探索工業(yè)酵母生產(chǎn)途徑，使之更好、更安全、更有效率地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn).