王　磊，　汪　蘋，　劉健楠，　尹明銳

(北京工商大學 化學與環(huán)境工程學院, 北京　100048)

固定化微生物技術主要有吸附法、載體結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法等[7-8]，幾種方法各有優(yōu)缺點. 包埋法對微生物活性影響小、顆粒強度高，是目前研究最多的固定化方法[9]. 包埋材料主要為天然多糖類凝膠和合成高分子凝膠兩類. 常見的天然高分子凝膠主要有：海藻酸鈉、卡拉膠、瓊脂等. 天然高分子載體一般對微生物無毒性,傳質(zhì)性能好,但強度低,厭氧條件下易被微生物分解,壽命短[9]. 合成高分子凝膠主要有：聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等[10]. 合成高分子凝膠載體抗微生物分解性好,機械強度高,化學穩(wěn)定性好,但傳質(zhì)性能較差,在包埋細胞的過程中會降低細胞活性[10]. 目前，有研究者將合成的與天然的高分子凝膠聯(lián)合使用，可彌補各自的缺點[11].

本研究擬采用單一包埋劑和混合包埋劑對WXZ-2菌包埋，通過對包埋小球菌體活性、機械強度、保存時間的考察，評價包埋效果，最終選出適合WXZ-2菌的包埋方法.

1　實驗部分

1.1　實驗材料及菌種

包埋劑：聚乙烯醇(PVA)(分析純)、瓊脂(分析純)、卡拉膠(分析純).

交聯(lián)劑：硼酸(分析純)、氯化鉀(分析純).

實驗菌種：WXZ-2(實驗室自篩)，經(jīng)測定該菌種具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能. 經(jīng)菌株鑒定為蠟狀芽胞桿菌.

1.2　培養(yǎng)基

反硝化培養(yǎng)基(DM)(g/L)：檸檬酸三鈉3.06，KNO30.722，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 1.0，調(diào)節(jié)初始pH為7.0.

硝化能力富集培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO4：0.47，KH2PO4：1.0，F(xiàn)eCl2·6H2O：1.25，CaCl2·7H2O：0.2，MgSO4·7H2O：1.0，檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)：5.1，碳源用量依據(jù)正交試驗設計COD/N調(diào)節(jié)，并同時調(diào)節(jié)初始pH值.

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO4：0.47；檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)：5.1；KNO3:0.1；維氏鹽溶液：50 mL.

維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO4：5.0；FeSO4·7H2O:0.05；NaCl：2.5；MgSO4·7H2O:2.5；MnSO4·4H2O：0.05.

1.3　實驗儀器及設備

高壓滅菌器、無菌操作臺、紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋、恒溫搖床、生化培養(yǎng)箱、冰箱.

1.4　實驗方法

1.4.1菌種的增殖

將WXZ-2菌涂于營養(yǎng)瓊脂上，增殖培養(yǎng)24 h，再將菌體轉(zhuǎn)移到硝化能力富集培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)48 h.

菌液以8 000 r/min離心5 min，得濕菌體，用無菌水洗兩次，放入冰箱待用.

1.4.2菌種的包埋方法

PVA法[12]：將PVA溶液45 mL(10%)與5 mL菌液(20%)混合，倒入飽和硼酸溶液，放入冰箱4 ℃交聯(lián)12 h，取出，用無菌水洗凈，切成3 mm見方的立方體，在生理鹽水中浸泡，再放入4 ℃冰箱中待用.

PVA-瓊脂法：將5%的聚乙烯醇和2.5%的瓊脂混合液45 mL，與5 mL菌液(20%)混合. 混合液用10 mL一次性注射器滴入飽和硼酸溶液制得小球，放入冰箱4 ℃交聯(lián)12 h，取出，用無菌水洗凈，用生理鹽水浸泡，放入4 ℃冰箱待用.

卡拉膠法[13-14]：將2.5%的卡拉膠溶液45 mL，與5 mL菌液(20%)混合. 混合液用10 mL一次性注射器滴入4%氯化鉀溶液中制得小球，放入冰箱4 ℃交聯(lián)12 h，取出，用無菌水洗凈，用生理鹽水浸泡，放入4 ℃冰箱待用.

PVA-卡拉膠[15-16]法：將5%的聚乙烯醇和1.5%的卡拉膠混合液45 mL，與5 mL菌液(20%)混合. 混合液用10 mL一次性注射器滴入飽和硼酸溶液和4%氯化鉀混合溶液中制得小球，放入冰箱4 ℃交聯(lián)12 h，取出，用無菌水洗凈，生理鹽水浸泡，放入4 ℃冰箱待用.

為方便下文論述，PVA小球、PVA-瓊酯小球、卡拉膠小球、PVA-卡拉膠小球分別命名為a、b、c、d.

1.4.3包埋小球活性的測定

測定方法[17]：

1.4.4包埋固定化小球機械強度的表征[10]

將60個小球放入250 mL錐形瓶，加入100 mL去離子水,在恒溫振蕩器上300 r/min振蕩12 h，完好的小球與原小球總數(shù)的比表示小球的強度系數(shù)[18].

1.4.5保存方法

烘箱干燥保存：將制備好的樣品放入40 ℃鼓風干燥箱中，干燥至恒重，取出，放入自封袋中保存. 放入無水CaCl2作干燥劑.

2　實驗結(jié)果與分析

2.1　包埋固定化小球的平均孔徑及孔密度

通過電鏡，測出4種小球平均孔徑及孔密度，見表1. 理論上，孔徑和孔密度越大，越有利于傳質(zhì). 其中b小球孔徑和孔密度最大，理論上傳質(zhì)效果最好.

表1　包埋小球孔徑及孔密度Tab.1　Diameter and pore density of embedding ball

2.2　包埋固定化小球的脫氮效果

2.2.1不同包埋材料對菌種反硝化性能的影響

圖1　小球的還原率隨時間變化情況 reduction rate with time-varying of the balls

溶解氧和污染物的傳質(zhì)阻力是影響固定化小球反硝化能力的主要因素. 小球內(nèi)部存在類似顆粒污泥的溶解氧梯度，因此可能會出現(xiàn)較低溶解氧的情況，這種條件更有利于反硝化反應的進行，所以包埋小球的反硝化能力并沒有受到影響. 污染物傳質(zhì)能力的不同導致各種小球反硝化速率的不同.

2.2.2不同包埋材料對菌種硝化性能的影響

圖2　小球的去除率隨時間變化情況 reduction rate with time-varying　of the balls

圖3為4種包埋小球TN去除率隨時間的變化圖，經(jīng)24 h后取樣，d小球的TN去除率與游離菌接近，達到60%，c小球和b小球的TN去除率只有50%左右，a小球最低. 48 h后，b小球的TN去除率超過其他樣品并達到90.5%，而d小球TN去除率只有81.5%. 其他兩種小球TN去除率仍然不高. 游離菌的TN去除率在72 h達到93.1%. b小球和d小球的去除率均有所下降，另兩種小球雖然去除率有所升高，仍不到80%.

圖3　小球的TN去除率隨時間變化情況Fig.3　TN reduction rate with time-varying of the balls

通過包埋小球與游離菌的活性比較，4種小球的硝化能力都有不同程度的損失，但是包埋后菌種的硝化性能并沒有改變.

2.3　轉(zhuǎn)速對包埋菌種活性的影響

圖4　a小球在不同轉(zhuǎn)速下的及TN去除率 &TN reduction rate of a ball

圖5　b小球在不同轉(zhuǎn)速下的及TN去除率 &TN reduction rate of b ball

圖6　c小球在不同轉(zhuǎn)速下的及TN去除率 &TN reduction rate of c ball

圖7　d小球在不同轉(zhuǎn)速下的及TN去除率 &TN reduction rate of d ball

圖8　游離菌在不同轉(zhuǎn)速下的及TN去除率 &TN reduction rate of WXZ-2

2.4　包埋固定化小球的機械性能

機械強度關系到固定化小球的使用壽命，因此，研究固定化小球的機械強度就顯得極為重要，實驗數(shù)據(jù)見表2. 從表2可以看出，a小球和b小球都有很好的機械強度，沒有任何破損，但是實驗發(fā)現(xiàn)，a小球粘連現(xiàn)象非常嚴重，所有小球都粘在一起，嚴重影響了傳質(zhì)，而b小球無粘連現(xiàn)象. c小球?qū)嶒炂茡p率達到90%，剩余的小球也處于半融解狀態(tài)；d小球破損率為10%，表現(xiàn)出較好的機械強度.

表2　4種小球的機械性能Tab.2　Mechanical properties of 4 balls

2.5　保存方法及時間對菌種活性的影響

圖9　小球活性隨保存時間的變化Fig.9　Active change following save time of balls以去除率表示菌種活性.

由于a小球包埋后菌種活性較低，c小球使用時破損率較高，因此它們未被選作進一步研究. 另兩種小球均采用烘箱干燥保存，研究保存時間對包埋后菌種活性的影響，實驗結(jié)果見圖9. 由圖9可以看出，隨著保存時間的增加，活性均有所降低，保存90 d后，b小球和d小球活性分別為85.7%和81.2%. 兩種小球活性下降不大，這是由于干燥固定化小球，使小球失水，小球表面的孔徑變得很小甚至封閉，可以認為在小球內(nèi)部給微生物提供一個隔氧、干燥、避光的環(huán)境，并且不會被雜菌污染，因此，兩種小球都表現(xiàn)出比較好的存貯穩(wěn)定性.

3　結(jié)　論

3) a小球和b小球機械強度最佳，c小球和d小球較差，a小球在制作過程中不易成球，使用過程中易粘連.

4) b小球和d小球經(jīng)過90 d的干燥保存，其活性分別為85.7%和81.2%.