叢艷君， 薛文通

(1.北京工商大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 北京 100048；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083)

1986年葉世泰等在我國(guó)常用食品致喘40例分析中指出，花生等油料作物位居食物過(guò)敏原的前列[1]. 流行病學(xué)研究顯示，約有3%的過(guò)敏反應(yīng)由食物誘發(fā)，危及生命的過(guò)敏反應(yīng)中有1/5是由花生引起[2]. 隨著全球化進(jìn)程，食品的生產(chǎn)、流通和消費(fèi)方式呈現(xiàn)國(guó)際化，花生過(guò)敏將成為各國(guó)共同關(guān)注的問(wèn)題. 我們前期研究工作表明：Ara h1和Ara h3系列蛋白為花生主要過(guò)敏原[3]. 探索花生脫敏方法對(duì)于保障消費(fèi)者安全和指導(dǎo)企業(yè)開(kāi)發(fā)低過(guò)敏食品均具有重要的意義.

致敏蛋白質(zhì)與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的僅為其部分抗原決定基(數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)氨基酸組成) ,因此掩蓋、破壞和去除此類(lèi)基團(tuán)、使引起過(guò)敏的抗原決定基不再為免疫系統(tǒng)識(shí)別是開(kāi)發(fā)低過(guò)敏性花生蛋白的關(guān)鍵[4]. 酶技術(shù)以其高效、反應(yīng)溫和、可控等優(yōu)點(diǎn)廣泛地應(yīng)用于植物蛋白修飾中. 國(guó)內(nèi)用于蛋白質(zhì)水解研究的酶大多是微生物蛋白酶，對(duì)動(dòng)植物蛋白酶的使用相對(duì)較少. 本研究的目的是降低烘烤花生蛋白的致敏性，即破壞花生過(guò)敏原的抗原決定簇，著眼于實(shí)際生產(chǎn)，在酶系的選擇過(guò)程中以工業(yè)化生產(chǎn)的食品級(jí)酶類(lèi)為主，探索單酶水解或多酶順序水解對(duì)花生致敏性的影響，篩選降低烘烤花生致敏性的最佳用酶.

1 材料與方法

1.1 材料

花生購(gòu)于北京市種子公司；堿性蛋白酶Alcalase，復(fù)合蛋白酶Protamex，固體木瓜蛋白酶Papain(S)，中性蛋白酶Neutrase，風(fēng)味蛋白酶Flavorzyme，胃蛋白酶Pepsin，Protease M均購(gòu)自丹麥諾維信公司；花生過(guò)敏患者血清由北京大學(xué)第三醫(yī)院友情提供.

1.2 儀器設(shè)備

BIO-RAD550型酶標(biāo)儀， IO-RAD公司；HZS-H型水浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；PSH500A型生化培養(yǎng)箱，中國(guó)重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1烘烤花生的制備及花生蛋白的提取[5]

以花育品種為試材，實(shí)驗(yàn)室自制花生制品. 170 ℃烘烤20 min制備烘烤花生.

花生仁用磨粉機(jī)磨成粉，按10 mL/g比例加入正己烷，于4 ℃振蕩過(guò)夜脫脂，然后4 ℃離心10 min(12 000 g)，取沉淀風(fēng)干得脫脂花生粉.

脫脂花生粉，按m/v為1∶20比例加入20 mmol/L磷酸緩沖溶液(1 mol/L氯化鈉，pH 7.8)，4 ℃振蕩提取4 h，，然后于4 ℃離心(14 000×g，10 min)，取上清液，4 ℃透析48 h之后凍藏備用.

1.3.2酶活力的測(cè)定

采用福林-酚試劑法[6]. 首先繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后測(cè)定蛋白酶活力，即以酪蛋白為底物，加入適當(dāng)稀釋的酶液,再加入碳酸鈉溶液和稀釋的福林-酚試劑，保溫顯色20 min后，在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酪氨酸含量.

1.3.3蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定[7]

蛋白質(zhì)水解度(Degree of hydrolysis, DH)的計(jì)算公式如下.

DH=(氨態(tài)氮/總氮)×100%

總氮測(cè)定采用凱式定氮法, 氨態(tài)氮的測(cè)定采用甲醛滴定法

1.3.4單酶水解

參照廠家提供的蛋白酶最適反應(yīng)條件，選定底物濃度為5%，充分?jǐn)嚢韬?，用恒溫水浴箱保持恒溫，加入蛋白? 水解過(guò)程中，不斷攪拌并加入0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值保持基本恒定，水解后取樣，所取樣品迅速煮沸3 min使酶失活，冷凍干燥后備用. 各種蛋白酶對(duì)花生蛋白的水解條件見(jiàn)表1，在所選蛋白酶的最適條件下，底物質(zhì)量濃度為0.05 g/mL，E：S為3 000 U/g蛋白質(zhì)，水解時(shí)間為8 h.

表1 各種蛋白酶對(duì)花生蛋白的水解條件Tab.1 The hydrolysis conditions of each emzyme to peanut protein

1.3.5雙酶分步水解

在單酶水解結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用能降低烘烤花生致敏性的蛋白酶兩兩組合，先將花生蛋白溶液調(diào)至第一種酶的水解條件，水解5 h后，調(diào)至第二種酶的水解條件，加入第二種酶，3 h后取樣(共水解8 h). 把所取樣品迅速煮沸3 min使酶失活，冷凍干燥后備用.

1.3.6SDS-PAGE[8]

花生蛋白水解物用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析，所用條件為分離膠濃度12.5%，濃縮膠濃度4.5%，膠聯(lián)度3.6%，進(jìn)行垂直電泳，單板恒流10 mA，樣品溶液先與等體積上樣緩沖液混合，沸水浴加熱5 min后，花生蛋白提取液5 μL(提取液質(zhì)量濃度為1 g/L)上樣；電泳后的分離膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯現(xiàn)蛋白帶，以低分子量蛋白做標(biāo)準(zhǔn).

1.3.7酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)

采用間接酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定花生蛋白酶解液致敏性強(qiáng)弱[9].

用包被液(50 mmol/L pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液)將花生蛋白稀釋成10 μg/mL濃度，每個(gè)樣品做三個(gè)平行；將收集的花生患者血清(一抗)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠抗人IgE(二抗)用封閉液稀釋?zhuān)缓箫@色反應(yīng)，終止后在450 nm波長(zhǎng)下讀取OD值. 以TBS-Tween孔為對(duì)照，以吸光度值反應(yīng)致敏性的變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶水解結(jié)果

除風(fēng)味蛋白酶(Flavorzyme)外，其它的蛋白酶水解到一定時(shí)間，水解度隨時(shí)間變化曲線趨于平緩，見(jiàn)圖1. Alcalase、Protamex、Neutrase和Protease M 4種微生物蛋白酶活性較高，水解到7個(gè)h水解度才保持恒定，而木瓜蛋白酶(Papain S)水解到2 h后水解度就開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，胃蛋白酶(Pepsin)在整個(gè)酶解過(guò)程中水解度都較低. 7種蛋白酶中，風(fēng)味蛋白酶水解程度最深，8 h水解度為8.9%，Alcalase蛋白酶次之為7.4%.

蛋白致敏性越低， OD值越低. 7種蛋白酶在各自實(shí)驗(yàn)室最優(yōu)酶解條件下，致敏性變化情況見(jiàn)圖2. 由圖2可見(jiàn)，胃蛋白酶的水解物致敏性最高，木瓜蛋白酶水解物致敏性也較高，4種微生物蛋白酶水解物IgE結(jié)合能力較低，其中Alcalase蛋白酶致敏性最低，另外風(fēng)味蛋白酶水解物致敏性也較低. 方差分析表明，不同蛋白酶水解花生蛋白致敏性差異顯著(p<0.05).

Alcalase活性較高，水解8個(gè)小時(shí)，花生蛋白致敏性降低了34.5%，風(fēng)味蛋白酶活性也較高，水解8小時(shí)，花生致敏性降低了32.1%.

圖1 花生蛋白酶水解過(guò)程中水解度的變化Fig.1 DH of peanut protein during hydrolysis

圖2 花生蛋白酶水解過(guò)程中致敏性的變化Fig.2 Allergenicity of peanut protein during hydrolysis

2.2 雙酶水解結(jié)果

雙酶組合水解對(duì)花生蛋白質(zhì)水解度的影響見(jiàn)圖3. 由圖3可知，水解8 h后，Alcalase和風(fēng)味蛋白酶組合水解花生蛋白水解度最高，其次為Alcalase和protease M蛋白酶組合，水解度最低為風(fēng)味蛋白酶和蛋白復(fù)合酶(Protamex)的組合.

雙酶組合水解物致敏性對(duì)比情況見(jiàn)圖4. 由圖4可知，雙酶組合水解產(chǎn)物致敏性差異顯著(p<0.05)，Alcalase和風(fēng)味蛋白酶組合水解致敏性最低為0.49，風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶、Alcalase和復(fù)合蛋白酶此兩組組合水解物IgE結(jié)合能力最高為0.56.

圖3 雙酶水解對(duì)水解度的影響Fig.3 DH of peanut protein hydrolyzed by two enzymes A為Alcalase F為flavorzyme PM為protease M P為protamex

圖4 雙酶組合水解產(chǎn)物致敏性Fig.4 Effect of various hydrolyzates on the allergenicity of peanut protein

P 未水解的花生蛋白;1 Pepsin;2 Papain (S);3 Neutrase;4 Protamex;5 Protease M;6 Flavorzyme;7 Alcalase;8 Alcalase+Flavorzyme;9 Protease M+Protamex;10 Alcalase+Protamex;11 Flavorzume+Protamex;12 Flavorzyme+Protease M;13 Alcalase+Protease M

2.3 蛋白酶水解花生蛋白電泳圖譜分析

單酶和雙酶組合水解花生蛋白電泳圖譜見(jiàn)圖5，除第6泳道風(fēng)味蛋白酶部分水解Ara h1和Ara h3外，其它泳道Ara h1和Ara h3均已水解完全.

3 討論與結(jié)論

Nondlee等[10]研究表明烘烤花生IgE結(jié)合能力高于原料花生. 花生在烘烤過(guò)程中蛋白發(fā)生了復(fù)雜的反應(yīng)產(chǎn)生新的致敏物質(zhì)而增強(qiáng)了致敏性[11],即熱處理的方法可能會(huì)引入新的抗原. 因此探索降低烘烤花生脫敏方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

Chung等[12]研究表明，過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)可通過(guò)引起花生過(guò)敏原Ara h1和Ara h2的聚合反應(yīng)而降低花生蛋白的致敏性. 過(guò)氧化物酶是氧化還原酶的一種，催化從底物移去電子,并轉(zhuǎn)給過(guò)氧化氫反應(yīng)，產(chǎn)生氧化的供體，在蛋白質(zhì)方面，主要表現(xiàn)為引起蛋白質(zhì)的聚合. 從食品科學(xué)角度，酶催化后產(chǎn)物的加工特性和感觀特性也是重要的考慮因素，因此，本研究主要選取食品級(jí)的蛋白酶作為花生脫敏的工具酶.

不同的蛋白酶具有不同的水解特異，所用酶的種類(lèi)及酶解條件的不同，會(huì)導(dǎo)致酶解產(chǎn)物及抗原性的降低也有所不同. Vieths等[13]模擬胃液對(duì)焙烤的花生蛋白進(jìn)行酶解反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶處理2h后，幾個(gè)IgE結(jié)合片斷被SDS-PAGE免疫印跡所識(shí)別. Astwood等[14]研究表明，Ara h1經(jīng)胃蛋白酶水解80min后仍可保持高穩(wěn)定性. 本研究所選胃蛋白酶催化部位是Tyr-, Phe-羧基端和氨基端及Leu-,Arg-羧基端，從理論上可以降解過(guò)敏原的作用表位，但是胃蛋白酶水解物的抗體滴度值最高，其原因可能有以下幾個(gè)方面：一方面胃蛋白酶是外肽酶，不能水解分子內(nèi)肽鍵，分子內(nèi)的抗原決定簇位點(diǎn)得以保存，從而不能有效降低花生的抗原性；另一方面花生蛋白主要抗原決定簇位于分子內(nèi)部，即使是在蛋白結(jié)構(gòu)熱變性的情況下，蛋白酶仍不能有效的催化底物；再有由于蛋白經(jīng)過(guò)水解，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變，隱蔽于原分子內(nèi)部的部位裸露于蛋白質(zhì)分子表面，產(chǎn)生新的抗原決定部位，反而增強(qiáng)了其抗原性，證實(shí)了Haddad等[15]的研究. 一般認(rèn)為，致敏原是一些耐熱耐消化的蛋白質(zhì)，具有抵抗胃腸道酶解的作用，胃蛋白酶催化花生蛋白水解物致敏性降低幅度較低，有力的證明了這一結(jié)論.

內(nèi)肽蛋白酶水解蛋白質(zhì)的實(shí)質(zhì)就是將底物蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂，釋放出小肽，在初始階段，斷裂的肽鍵數(shù)目很多，敏感性肽鍵快速斷裂，水解速度很快，表現(xiàn)在Alcalase,Protamex,Protease M,Neutrase,木瓜蛋白酶前6個(gè)小時(shí)水解度增加較快，而水解肽濃度升高，又反過(guò)來(lái)抑制水解速度，表現(xiàn)為后兩個(gè)小時(shí)，水解度增加較慢. 外肽蛋白酶不能水解分子內(nèi)肽鍵，分子內(nèi)大量的抗原位點(diǎn)得以保存，所以風(fēng)味蛋白酶和胃蛋白酶不能有效降低花生蛋白的抗原性.

雙酶組合酶解花生蛋白水解度明顯高于單酶水解物，但是抗體滴度值差異不大，這與酶的特異性有關(guān)，只有將抗原抗體結(jié)合的抗原決定簇打斷，才能真正實(shí)現(xiàn)降低花生致敏性. 患者血清中的IgE抗體是由未被完全消化的致敏蛋白免疫產(chǎn)生的，當(dāng)患者產(chǎn)生了IgE抗體后其抗體會(huì)與抗原表位結(jié)合，即使致敏蛋白被水解，只要還有殘存的2個(gè)以上的表位(10kDa)即可與之結(jié)合而誘發(fā)疾病[4].

加熱和酶解有可能產(chǎn)生隱位而提高過(guò)敏原的致敏性[16]. 本研究所選的蛋白酶沒(méi)有出現(xiàn)提高過(guò)敏原致敏性的現(xiàn)象，這可能與底物蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和蛋白酶催化底物的特異性有關(guān).

Jost等研究表明，水解度與水解產(chǎn)物過(guò)敏性之間沒(méi)有相關(guān)性[17]. 沈小琴[18]也得出同樣的結(jié)論,即水解度和抗原抑制率沒(méi)有一定的相關(guān)性,水解度高時(shí),抗原抑制率不一定高,而水解度低時(shí),抗原抑制率也不一定低. 本研究對(duì)不同蛋白酶水解花生蛋白的水解度和抗體滴度值做相關(guān)分析，未得出規(guī)律的相關(guān)性，因此，水解度和抗體滴度值之間無(wú)相關(guān)性.

在單酶、雙酶篩選試驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮蛋白水解的工藝復(fù)雜性及成本，本研究認(rèn)為Alcalase單酶水解方法為降低烘烤花生致敏性的最佳方案.