陜西省榆林市第二醫(yī)院(榆林 719000)

李冠雄 李 萍 楊中民 房宏林 趙 旭 張 磊* 許延發(fā)*

胃癌是胃腸系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一,其發(fā)生不僅與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān),還與細(xì)胞增殖和凋亡的失衡有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因及其與胃癌關(guān)系的研究,對(duì)了解胃癌發(fā)病機(jī)制和其生物學(xué)行為有重要意義。HSP27是熱休克蛋白家族中重要成員,在腫瘤凋亡及腫瘤耐藥中起重要作用,其表達(dá)與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族的新成員,是較強(qiáng)的凋亡抑制因子,其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)。為此,我們研究 HSP27和 Survivin在胃癌組織中表達(dá)的意義及相關(guān)性,探討胃癌診斷和基因治療的新思路。

資料與方法

1 臨床資料 陜西省榆林市第二醫(yī)院 2002年4月至 2003年 5月收治的胃癌手術(shù)患者 45例,均經(jīng)病理學(xué)檢查確診,患者術(shù)前均未行任何放療和化療。其中男 23例 ,女 22例;年齡 29～ 70歲 ,平均 56.8歲 ,其中≥60歲 24例,＜60歲 21例。 腫瘤分化程度:高、中分化 18例,低分化 27例。 浸潤(rùn)深度:漿膜內(nèi) 13例,侵及漿膜 12例,侵及漿膜外 20例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 29例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 16例。取本組病例中距癌遠(yuǎn)端 2～4cm處癌旁組織 30例,正常胃黏膜標(biāo)本 20例作為研究對(duì)照。

2 方 法 取材后,立即用生理鹽水沖洗至無(wú)血跡后,10%福爾馬林固定,石蠟包埋,制作石蠟切片。免疫組織化學(xué) SP法檢測(cè) HSP27和 Survivin的表達(dá)。鼠抗人 HSP27單克隆抗體和鼠抗人 Survivin單克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 i2檢驗(yàn),應(yīng)用 SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié) 果

1 胃癌組織中 HSP27的表達(dá) 見(jiàn)表 1～ 2。 45例胃癌組織中 HSP27陽(yáng)性表達(dá) 31例(68.9%),癌旁組織中 HSP27陽(yáng)性表達(dá) 8例(26.7%),正常胃黏膜中 HSP27陽(yáng)性表達(dá) 4例(20.0%),兩組相比有極顯著性差異(i2=19.48,P＜0.01);高、中分化胃癌 HSP27的陽(yáng)性率為50.0%(9/18例),低分化胃癌中 HSP27陽(yáng)性率為 81.5%(22/27例),二者相比有顯著性差異(i2=4.99,P＜0.05)。HSP27表達(dá)與性別、年齡和胃癌的浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

2 胃癌組織中 Survivin的表達(dá) 見(jiàn)表 1～ 2。45例胃癌組織中有 29例(64.4%)陽(yáng)性表達(dá),而癌旁組織中 Survivin陽(yáng)性表達(dá) 2例(6.7%),正常胃黏膜中Survivin陽(yáng)性表達(dá) 2例(10.0%),兩組相比有極顯著性差異 (i2=33.34,P＜0.01);高、中分化胃癌Survivin的陽(yáng)性率為 44.4%(8/18例),低分化胃癌中Survivin陽(yáng)性率為 77.8%(21/27例),二者相比有顯著性差異(i2=5.24,P＜0.05)。 Survivin的表達(dá)與性別、年齡和胃癌的浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

3 HSP27和 Survivin表達(dá)之間的相關(guān)性 作兩者的相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn) HSP27和 Survivin在胃癌中的表達(dá)正相關(guān)(i2=7.32,P＜0.01),見(jiàn)表 3。

4 結(jié)果判定 HSP27和 Survivin陽(yáng)性表達(dá)均分布于胞漿中,呈棕黃或棕褐色(見(jiàn)圖 1～ 2)。每張切片隨機(jī)取 2個(gè)高倍視野并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)10%者即為陽(yáng)性,否則為陰性。

圖1 胃癌組織中 HSP27的表達(dá)(SP染色×200)

圖2 胃癌組織中 Survivin的表達(dá)(SP染色×200)

表1 HSP27、Survivin在正常黏膜、癌旁組織、胃癌組織中的表達(dá)

討 論

HSP27基因定位在染色體 7q21,全長(zhǎng)約 1.60kb,含3個(gè)外顯子。其基因無(wú)內(nèi)含子,這一基本特征保證了一旦起始轉(zhuǎn)錄不需要剪接就可產(chǎn)生出成熟的 mRNA,以適應(yīng) HSP27大量快速表達(dá)的需要。 HSP27蛋白是 HSP27基因的表達(dá)產(chǎn)物,分子量 27kDa,由 132～186個(gè)氨基酸組成,其 N端為一個(gè)具三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合區(qū)和ATP酶活性的高度保守序列,C端為一個(gè)相對(duì)可變的基質(zhì)識(shí)別序列,后者傾向于與蛋白質(zhì)尚未折疊或折疊結(jié)構(gòu)被有害因素破壞的肽鏈結(jié)合,并依靠其 N端的ATP酶活性,通過(guò) AT P促成這些肽鏈的正確折疊(或再折疊)、移位、修復(fù)或降解。在非應(yīng)激條件下由單一HSP27蛋白形成一個(gè) 200～ 800kDa,10～18S的多聚復(fù)合物[1]。 HSP27的細(xì)胞內(nèi)定位,寡聚化水平和磷酸化狀態(tài)都與它對(duì)生物學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān),其表達(dá)可保護(hù)細(xì)胞抵抗各種刺激,如理化因素、細(xì)胞因子引起的細(xì)胞凋亡。

表2 HSP27、Survivin表達(dá)與性別、年齡及生物學(xué)特性的關(guān)系

表3 HSP27、Survivin表達(dá)的相關(guān)性分析

HSP27在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的主要作用是:(1)在內(nèi)源性凋亡途徑中,抑制細(xì)胞色素 C的釋放,并干擾細(xì)胞色素 C與其他物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物。 Concannon[2]發(fā)現(xiàn) HSP27可以干擾細(xì)胞色素 C與其它物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物,影響 Caspase-9的活化,從而抑制 Caspase-3和Caspase-7,發(fā)揮抑制凋亡的作用。Sanna從另一方面證明 HSP27在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用是抑制細(xì)胞色素 C的釋放[3]。 Smac是另一種線粒體來(lái)源的蛋白質(zhì),它能與凋亡蛋白抑制物質(zhì)結(jié)合,抑制它們的活性,促進(jìn)Caspase-9的活化,Chauhan等[4]發(fā)現(xiàn) HSP27能抑制細(xì)胞色素 C的釋放,也能抑制 Smac的釋放。 (2)在外源性凋亡途徑中,HSP27可以抑制 Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5]。有報(bào)道 HSP27在絲氨酸殘基 15,78,82位點(diǎn)磷酸化后可與 IKK相互作用抑制 TNF-α誘導(dǎo)的 NF-KB的活化,用 siRNA技術(shù)抑制 HSP27的表達(dá)可上調(diào)TNF-α介導(dǎo)的 IKK和 NF-KB的活化[6]。HSP27通過(guò)這兩種方式抑制凋亡,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn):胃癌組織中 HSP27的表達(dá)上調(diào),提示其與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在胃癌中,低分化組織 HSP27的表達(dá)高于高、中分化組織,提示 HSP27表達(dá)是胃癌預(yù)后不良的因素之一。

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的 IAP家族成員 (IAP:inhibitor of apoptosis家族是一類分布廣泛的凋亡抑制基因家族),因其在正常組織內(nèi)很少表達(dá)、而選擇性表達(dá)于惡性腫瘤組織的獨(dú)特表達(dá)特性而受到矚目[7]。Survivin基因全長(zhǎng) 15kb,位于 17q25,含有 4個(gè)外顯子和 3個(gè)內(nèi)含子,基因編碼產(chǎn)生含 142個(gè)氨基酸的蛋白。Survivin蛋白是迄今發(fā)現(xiàn)的一種分子量最小的 IAP蛋白 (分子量 16.5kD),結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特:僅含有單一的BIR區(qū)和 COOH-末端 65A具有兩性的α-螺旋區(qū),無(wú)環(huán)指結(jié)構(gòu)[8]。

Survivin作用于凋亡通路的下游,主要通過(guò)兩條途徑抑制細(xì)胞凋亡:(1)通過(guò)直接抑制凋亡終末效應(yīng)器Caspase-3和 Caspase-7的活性阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[9];(2)Survivin與周期蛋白酶 Cdk4、p34cdc2相互作用阻斷凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。Survivin依賴細(xì)胞增殖信號(hào)進(jìn)入核內(nèi)與 Cdk4結(jié)合,導(dǎo)致 Cdk2/CyclinE激活和 Rb蛋白磷酸化,啟動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入增殖周期,加快 G1→ S期的轉(zhuǎn)換,同時(shí)使 p21從 Cdk4復(fù)合體中釋放出來(lái),p21易位到線粒體與 proCaspase-3形成復(fù)合物,抑制 Caspase-3的活性,阻斷線粒體釋放細(xì)胞色素 C從而抑制細(xì)胞凋亡[10]。張生軍等[11,12]對(duì)Survivin,HSP-70基因在胃癌中的表達(dá)研究證實(shí)Survivin,HSP-70基因與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)胃癌組織中 Survivin的表達(dá)上調(diào),提示其與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在胃癌中,低分化組織Survivin的表達(dá)高于高、中分化組織,提示 Survivin表達(dá)是胃癌預(yù)后不良的因素之一。

腫瘤發(fā)生最突出的表現(xiàn)是細(xì)胞的失控性增殖,這與凋亡調(diào)控失常有關(guān)。本研究結(jié)果表明,胃癌組織Survivin和 HSP27的表達(dá)存在相關(guān)性,提示二者通過(guò)抗凋亡機(jī)制對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展有協(xié)同作用。目前,針對(duì)HSP27和 Survivin的靶向治療尚處于初步的實(shí)驗(yàn)研究階段,有關(guān)各種治療策略的療效尚需進(jìn)一步深入研究,但是可以預(yù)見(jiàn),針對(duì) HSP27和 Survivin的靶向治療與其他促凋亡治療相結(jié)合,將能最大限度地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),還可彌補(bǔ)某些治療上的不足[13～15],起到更好的療效。

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