江蘇省南通市中醫(yī)院外科(南通 226001)秦旭東 丁 偉 姚祖仁 陸海舟

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(W HO)2003年公布的資料顯示,肺癌無(wú)論是發(fā)病率(120萬(wàn) /年 )還是病死率(110萬(wàn) /年),均居全球癌癥首位。腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移實(shí)質(zhì)上是人體免疫功能失常所致。大量的研究證明免疫功能失調(diào)、特別是 T細(xì)胞免疫功能失常,使腫瘤細(xì)胞在發(fā)生早期能夠逃逸免疫監(jiān)控和免疫攻擊,從而發(fā)展至臨床階段。近年來(lái),T細(xì)胞共刺激分子 B7家族有了很大的擴(kuò)展。最新發(fā)現(xiàn)B7家族成員 B7-H4在體外通過(guò)抑制 T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生,負(fù)性調(diào)節(jié) T細(xì)胞反應(yīng)[1]。免疫組化分析顯示,B7-H4在正常外周組織中幾乎沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá),而在一些卵巢癌和乳腺癌中有豐富表達(dá)[2～4]。所以,推測(cè)B7-H4具有減輕炎性反應(yīng)和下調(diào)抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用。為探索一種新的診斷和治療食管癌的靶目標(biāo),本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色對(duì) B7-H4在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)進(jìn)行了研究。

資料與方法

1 臨床資料 南通市中醫(yī)院普外科于 2004年6月至 2008年 6月診治原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌患者 80例。其中男 52例,女 28例,診斷時(shí)平均年齡 57.2歲,腺癌 38例,鱗癌 42例;13例高分化,45例中分化,22例低分化。根據(jù)手術(shù)和病理發(fā)現(xiàn)及美國(guó)聯(lián)合會(huì)癌癥分期手冊(cè)進(jìn)行分期:Ⅰ期 18例,Ⅱ期 26例,Ⅲ期 34例。根據(jù) 1999年修正的最新分類法確定細(xì)胞分化程度。

2 主要試劑 兔抗人 B7-H4多克隆抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Vltra Sensitive S-P超敏試劑盒和 DAB顯色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

3 免疫組織化學(xué)染色 采用 SP法。按照福建邁新生物技術(shù)有限公司 SP即用型試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體操作步驟:福爾馬林固定手術(shù)標(biāo)本,石蠟包埋,切片厚度 4 μ m,二甲苯脫蠟,階梯酒精內(nèi)水化。切片經(jīng)3%H2O2孵育 15min,然后置于檸檬酸鈉緩沖液(CBS,0.01mol/L,pH6)中,微波(850W)修復(fù)抗原至沸騰即止,待緩沖液自然冷卻后取出切片,依次滴加 A液(過(guò)氧化物酶阻斷劑 )孵育 15min,B液 (正常羊血清)孵育15min,兔抗人 B7-H4多克隆抗體(1∶100)4℃孵育過(guò)夜,C液 (生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG)孵育 15min,D液(鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液)孵育 15min,以上各步驟之間用 PBS洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水透明,中性樹(shù)膠封片。實(shí)驗(yàn)組切片染色同時(shí)分別用 PBS、正常羊血清代替一抗,以上述步驟處理同樣切片作為空白對(duì)照和替代對(duì)照染色。

4 B7-H4的表達(dá)分析 用 SP-2000病理圖文報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。通過(guò)計(jì)數(shù)在胞膜上或 P和胞漿內(nèi)有陽(yáng)性染色的細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行組織學(xué)分析 B7-H4的表達(dá)。在 400倍鏡下隨機(jī)選擇的 5個(gè)腫瘤區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 B7-H4的染色強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比進(jìn)行半定量分級(jí):0: ＜ 10%;(+):10%～40%;(?):40%～80%;(?):＞ 80%。結(jié)果判斷:＜10%為陰性;10%～100%為陽(yáng)性。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用 SPSS12進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。進(jìn)行i2檢驗(yàn)和 Fisher精確檢驗(yàn)分析 B7-H4的表達(dá)及其與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系。以P ＜0.05為有顯著性差異,P ＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 B7-H4在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá) 非小細(xì)胞肺癌組織中 B7-H4呈彌漫性表達(dá),在胞漿和胞膜均有表達(dá)(見(jiàn)圖 1),80例非小細(xì)胞肺癌組織中,B7-H4表達(dá)的陽(yáng)性率為 37.5%(30/80)。陽(yáng)性者表達(dá)強(qiáng)度大部分在 (? )以上 (見(jiàn)圖 1)。

2 在非小細(xì)胞肺癌中 B7-H4的表達(dá)及其與病理特征的關(guān)系 見(jiàn)附表。鱗癌和腺癌患者 B7-H4陽(yáng)性表達(dá)率間無(wú)顯著性差異(P＞ 0.05);不同年齡、性別、吸煙史或分化程度患者 B7-H4陽(yáng)性表達(dá)率間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者 B7-H4的陽(yáng)性表達(dá)率間有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色(SP×100)非小細(xì)胞肺癌組織B7-H4陽(yáng)性表達(dá)(?)

圖2 免疫組織化學(xué)染色(SP×100)非小細(xì)胞肺癌組織B7-H4陰性表達(dá)

討 論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤,治療方面目前主張以手術(shù)為主的多學(xué)科綜合治療,尚無(wú)更確切有效的治療方法,而且影響預(yù)后的因素不甚明確。非小細(xì)胞肺癌是肺癌常見(jiàn)的類型,預(yù)后較差,肺癌化學(xué)治療雖能降低癌癥病死率,但現(xiàn)有的抗腫瘤藥具有殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也有較大的殺傷性副作用,同時(shí)易出現(xiàn)耐藥。免疫治療是近年來(lái)科學(xué)工作者廣泛認(rèn)同的較為理想的腫瘤治療方法,其療效提高的關(guān)鍵有賴于對(duì)腫瘤局部免疫微環(huán)境的深入了解。大量的分子生物學(xué)研究證實(shí),免疫功能失調(diào),特別是 T細(xì)胞免疫功能失常,使腫瘤細(xì)胞在發(fā)生早期能夠逃逸免疫監(jiān)控和免疫攻擊,進(jìn)而發(fā)展至臨床階段。尋找有價(jià)值的分子標(biāo)志物或者非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因?qū)⒂兄诮沂痉切〖?xì)胞肺癌發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制。

附表 不同臨床病理因素影響下 B7-H4的表達(dá)情況

20世紀(jì) 80年代以來(lái),人們認(rèn)識(shí)到 T淋巴細(xì)胞的活化需涉及多種細(xì)胞間大分子物質(zhì)的相互作用。隨著T細(xì)胞活化信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究的不斷深入,與 B7分子有關(guān)的共刺激通路及抑制通路在感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥反應(yīng)中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注[7]。

B7-H4(又稱 B7s1和 B7x)是 B7家族中的最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新成員[5～7],它能通過(guò)抑制 T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞周期的進(jìn)程來(lái)負(fù)性調(diào)控 T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

2003年,Chen等[5～7]三個(gè)實(shí)驗(yàn)室利用生物信息學(xué)的方法相繼發(fā)現(xiàn)了 B7-H4分子。 B7-H4表達(dá)在專職APC和廣泛分布在非淋巴組織上[5]。Northern Blot分析示 h B7-H4mRNA在脾、肺和胸腺組織表達(dá)豐富。有RT-PCR顯示,在所有鼠組織中均檢測(cè)到 m RNA[5]。在某些腫瘤組織(如卵巢癌、乳腺癌、子宮腫瘤和肺癌等)中發(fā)現(xiàn) B7-H4的組成性高表達(dá)[2～4,8～14]。在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上表達(dá)的 B7-H4可以抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。大部分的人類腫瘤的肺癌[15],卵巢癌[13],乳腺癌[16]細(xì)胞表面表達(dá) B7-H4。

Zhang等[6]證實(shí)細(xì)胞表面表達(dá)的 B7-H4可以抑制T細(xì)胞反應(yīng)。此外前期研究工作還發(fā)現(xiàn),B7-H4的調(diào)控作用能使 T細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在 G0/G1期[5],體內(nèi)輸入 B7-H4Ig抑制同種反應(yīng)性 CTL活性。 B7-H4Ig在體內(nèi)能抑制 CD8+ CTL的增殖和成熟[5]。內(nèi)源性 B7-H4可以抑制同種性 CT L的產(chǎn)生,支持內(nèi)源性 B7-H4在抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的作用[5]。另外李文樺實(shí)驗(yàn)證實(shí)[17],如果將不表達(dá)或低表達(dá) B7-H4mRNA的腫瘤細(xì)胞株接種小鼠,形成的腫瘤組織不僅高表達(dá)其mRNA,而且高表達(dá) B7-H4蛋白分子。

Sica等人發(fā)現(xiàn) B7-H4抑制了 T細(xì)胞反應(yīng)。B7-H4Ig也明顯抑制了 IL-2和 IL-10的產(chǎn)生。 B7-H4Ig能抑制B7-1共刺激的 T細(xì)胞分泌 IL-2、4、10和 IFN-γ。 結(jié)果顯示 B7-H4誘導(dǎo)的 T細(xì)胞增殖抑制不能被 CD28共刺激所逆轉(zhuǎn)[7]。 Kryczek等在研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中IL-6、IL-10含量的升高,刺激了巨噬細(xì)胞 B7-H4的表達(dá),與之相對(duì)應(yīng),CSF、IL-4抑制了巨噬細(xì)胞 B7-H4的表達(dá)[18]。B7-H4的異常表達(dá),使正常的巨噬細(xì)胞具有了抑制功能。因而 B7-H4陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞在卵巢癌中構(gòu)成了一個(gè)新的抑制性細(xì)胞群。

綜上所述,非小細(xì)胞肺癌組織表達(dá) B7-H4對(duì)機(jī)體的抗腫瘤免疫發(fā)揮抑制作用,參與免疫逃逸。由于腫瘤類型、發(fā)生部位以及腫瘤微環(huán)境中諸多因素共同影響著腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊,因而深入研究B7-H4參與腫瘤免疫逃逸的機(jī)制對(duì)腫瘤免疫治療具有十分重要的指導(dǎo)意義,通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞上 B7-H4的表達(dá),將成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

[1]Flies DB,Chen L.The new B7s:playing a pivotal role in tumor immunity.J Immunother,2007,30(3):251-260.

[2]M ugler KC,Singh M,TringlerB,et al.B7-h4 expression in a range of breast pathology:correlation with tumor T-cell infiltration. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007,15(4):363-370.

[3]Kryczek I,Wei S,Zhu G,et al.Relationship between B7-H4,regulatory T cells,and patient outcome in human ovarian carcinoma.CancerRes,2007,67(18):8900-8905.

[4]Zheng Y, Katsaros D, Shan SJ,etal. A multiparametric panelforovarian cancer diagnosis,prognosis,and response to chemotherapy.Clin Cancer Res,2007,13(23):6984-6992.

[5]Sica GL,Choi IH,Zhu G,et al.B7-H4,a molecule of the B7family,negatively regulates T cell immunity.Immunity,2003,18(6):849-861.

[6]Zang X,Loke P,Kim J,et al.B7x:a widely expressed B7family member that inhibits T cell activation.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(18):10388-10392.

[7]Prasad DV,Richards S,Mai XM,et al.B7S1,a novel B7 family member that negatively regulates T cell activation.Immunity,2003,18(6):849-861.

[8]Salceda S, Tang T, KmetM,etal. The immunomodulatoryprotein B7-H4is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation.Exp Cell Res,2005,306(1):128-141.

[9]Miyatake T,Tringler B,Liu W,et al.B7-H4(DDO-110)isoverexpressed in high risk uterine endometrioid adenocarcinomas and inversely correlated with tumor T-cell infiltration.Gynecol Oncol,2007,106(1):119-127.

[10]Simon I,Katsaros D,Rigault de la Longrais I,et al.B7-H4is over-expressed in early-stage ovarian cancer and is independent ofCA125expression. Gynecol Oncol,2007,106(2):334-341.

[11]Simon I,Liu Y,Krall KL,et al.Evaluation of the novel serum markers B7-H4,Spondin 2,and DcR3for diagnosis and early detection of ovarian cancer.Gynecol Oncol,2007,106(1):112-118.

[12]Simon I,Zhuo S,Corral L,et al.B7-H4is a novel membrane-bound protein and a candidate serum and tissue biomarker for ovarian cancer.Cancer Res,2006,66(3):1570-1575.

[13]TringlerB, Liu W, CorralL,etal. B7-H4overexpression in ovarian tumors.Gynecol Oncol,2006,100(1):44-52.

[14]Sun Y,Wang Y,Zhao J,et al.B7-H3and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer.Lung Cancer,2006,53(2):143-151.

[15]Choi IH,Zhu G,Sica GL,et al.Genomic organization and expression analysis of B7-H4,an immune inhibitory molecule of the B7family. J Immunol,2003,171(9):4650-4654.

[16]Tringler B,Zhuo S,Pilkington G,et al.B7-H4is highly expressed in ductal and lobular breast cancer.Clin Cancer Res,2005,11(1):1842-1848.

[17]李文樺,劉瑞梓,楊秀利.腫瘤模型中 B7-H4和 BTLA的異常表達(dá).中國(guó)癌癥雜志,2005,15(4):313-316.

[18]Suh WK,Wang S,Duncan GS,et al.Generation and characterization of B7-H4/B7S1/B7x-deficient mice.Mol Cell Biol,2006,26(17):6403-6411.