第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院,腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室(西安 710032)

張永國 王 新 劉 霖 柴 娜 李泉江 吳開春

小檗堿(Berberine)是從黃連、黃柏等多種植物中提取(或人工合成)的生物堿,具有廣泛的生物學(xué)作用。在中國,小檗堿用于治療腹瀉已有數(shù)千年的歷史,但其作用機制尚未完全闡明。既往研究認(rèn)為小檗堿主要通過抑菌作用來實現(xiàn)腹瀉的治療,但是僅僅抑菌作用并不能解釋全部,特別是分泌性腹瀉。在動物模型,小檗堿可以逆轉(zhuǎn)霍亂毒素引起的腹瀉[1];更有臨床試驗表明,在大腸桿菌和霍亂弧菌引起的腹瀉中,小檗堿可以明顯減少糞便排出的體積[2]。為進一步探討小檗堿治療腹瀉的分子機制,本研究利用番瀉苷 A誘導(dǎo)建立BALB/c小鼠的腹瀉模型,并給予小檗堿治療處理,采用半定量 RT-PCR和免疫組化的方法檢測影響腸管水鈉吸收的鈉-氫交換體 1(NHE1)和鈉-氫交換體 3(NHE3)的表達情況。

材料與方法

1 材料和試劑 BALB/c小鼠 (20～ 22g)由第四軍醫(yī)大學(xué)動物試驗中心提供、鹽酸小檗堿(Sigma)、番瀉苷 A(成都曼斯特生物公司)、Trizol(Invitrogen)、First Strand cDNA Synthesis試劑盒 (Fermentas)、2× PCRMasterMix(北京天根)、NHE3羊抗多克隆抗體(SANT A CRUZ)、免疫組化試劑盒(北京中杉 )、DAB試劑盒(北京中杉)。

2 方 法

2.1 腹瀉模型的建立及小檗堿治療處理 取體重為 20～ 22g的雄性 BALB/c小鼠,隨機分為空白對照組、腹瀉組和處理組,每組 6只?？瞻讓φ战M給予生理鹽水灌胃、腹瀉組每隔 12h給予 20mg/kg番瀉苷 A灌胃;處理組在給予 20mg/kg番瀉苷 A的同時,于30min后給予 80mg/kg小檗堿治療處理。小鼠單籠單只飼養(yǎng),籠底墊濾紙,計數(shù) 12h內(nèi)每只小鼠的腹瀉次數(shù)。連續(xù)處理 1周后,處死小鼠,取近端結(jié)腸用于半定量 PCR及免疫組織化學(xué)的檢測。

2.2 總 RNA提取及 RT-PCR檢測 分離小鼠近端結(jié)腸,刮取腸黏膜上皮細胞,采用異硫氰酸胍 /苯酚法提取總 RNA。取所提取的總 RNA 8 μ g,按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒操作說明,逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA用于下一步的 PCR擴增反應(yīng)。 PCR反應(yīng)體系為 20 μ l:cDNA 1 μ l、上下游引物各1 μ l、2× MasterMix 10 μ l和 ddwater 7 μ l。 具體引物序列及反應(yīng)條件,見附表。

附表 PCR引物序列、退火溫度及循環(huán)數(shù)

2.3 免疫組化檢測 分離小鼠近端結(jié)腸,于 4%多聚甲醛中固定 24h、石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片。切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水,0.3%H2O2-甲醇溶液室溫封閉內(nèi)源性過氧化酶 30 min,滴加一抗 NHE3(1∶200)4℃過夜。復(fù)溫 30min后滴加二抗-HRP多聚體于 37℃放置 30 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片。

結(jié) 果

1 腹瀉模型的建立及小檗堿治療效果的觀察空白對照組所有小鼠均無腹瀉癥狀出現(xiàn),而腹瀉組小鼠在給予 20mg/kg番瀉苷 A灌胃 1～ 1.5h后,均出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀,如大便次數(shù)增多、糊狀便及水樣便,這些癥狀約持續(xù) 5～ 6h。小檗堿治療處理組小鼠,腹瀉癥狀得到很好的控制,很少出現(xiàn)糊狀便及水樣便。通過計數(shù)番瀉苷 A灌胃后 12h內(nèi)糊狀便及水樣便次數(shù),可發(fā)現(xiàn)小檗堿處理組糊狀便及水樣便的次數(shù)明顯少于腹瀉組 (0.14± 0.05 VS 8.57± 0.1,P ＜ 0.05)。

2 小檗堿對 N HE1和 NHE3mRNA表達的影響RT-PCR結(jié)果 (見圖 1)提示,NHE1和 NHE3mRNA在正常對照組、腹瀉組及小檗堿處理組均有表達。其中腹瀉組小鼠 NHE3m RNA的表達較正常對照組及小檗堿治療處理組明顯減少,其表達量約是正常對照組及小檗堿治療處理組的三分之一,具有顯著性差異(P＜0.05);但 N HE1mRNA的表達在三組間并無明顯差異(P＞0.05)。這一結(jié)果提示小檗堿可以在 RNA水平上影響 NHE3而不是 NHE1的表達。

圖1 RT-PCR檢測小鼠模型中 N HE1和 N HE3mRN A的表達和相對表達量 (±s,n=6,*P＜0.05)

3 小檗堿對 NHE3蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果(見圖 2)顯示 NHE3蛋白主要表達于結(jié)腸上皮刷狀緣。在正常小鼠結(jié)腸上皮 NHE3蛋白呈中度表達;而在番瀉苷 A誘導(dǎo)的腹瀉小鼠,NHE3的蛋白表達明顯減少,呈少量表達乃至陰性表達;但接受小檗堿治療處理的小鼠近端結(jié)腸上皮細胞 NHE3蛋白的表達重新上調(diào),呈中度表達。這些結(jié)果提示在番瀉苷 A誘導(dǎo)的小鼠腹瀉模型中,小檗堿可以在蛋白水平上上調(diào) NHE3的表達。

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠近端結(jié)腸 N HE3的表達(×400)

討 論

小檗堿對霍亂毒素或致病性大腸桿菌引起的分泌性腹瀉具有良好的療效[2],提示小檗堿可能通過影響腸管分泌或吸收來發(fā)揮治療腹瀉的作用。

生理狀態(tài)下,腸管上皮細胞存在大量離子通道及轉(zhuǎn)運體,維持腸管的吸收和分泌處于平衡狀態(tài)[3]。但當(dāng)致瀉物質(zhì),如細菌、病毒感染和毒素等作用于腸管時,這些離子通道及轉(zhuǎn)運體的表達和(或)活性就會發(fā)生改變,從而打破吸收和分泌間的平衡,造成大量的水電解質(zhì)丟失,嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者的死亡。

鈉-氫交換體(NHE)是一類跨膜蛋白家族,由 9個成員組成,其中 NHE1～4、NHE7和 NHE8已被證實表達于人腸道上皮,NHE通過介導(dǎo) Na+與 H+的交換,參與機體對 NaCl的吸收、維持機體電解質(zhì)平衡。NHE1廣泛表達于腸管上皮細胞基底外側(cè)膜,通過影響 Na+吸收,在生理狀態(tài)下參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi) pH值及細胞容積,病理狀態(tài)下其表達下調(diào)與炎癥性腸病時腹瀉的發(fā)生密切相關(guān)[4]。 NHE3主要表達于結(jié)腸上皮細胞刷狀緣,參與多種生理病理過程。生理情況下,NHE3主要通過介導(dǎo)腸腔內(nèi) Na+與腸上皮細胞內(nèi) H+的交換,促進腸管對鈉離子吸收,進而形成滲透梯度,增加腸管對水的被動吸收[5]。病理狀態(tài)下,NHE3與腹瀉的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn) NHE3基因敲除的小鼠,腸管對鈉水的吸收明顯減少并出現(xiàn)明顯的腹瀉[6],同時在炎癥性腸病及霍亂毒素誘導(dǎo)的腹瀉中,NHE3的表達和活性均受到明顯的抑制[7,8]。

本研究利用番瀉苷 A誘導(dǎo)建立 BALB/c小鼠的腹瀉模型,并給予小檗堿治療處理,檢測了影響腸管鈉水吸收的 NHE1和 NHE3的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論是在 RNA水平還是蛋白質(zhì)水平,小檗堿治療組小鼠近端結(jié)腸上皮細胞 NHE3的表達水平較腹瀉組小鼠明顯增高,而 NHE1的表達水平并無明顯變化。

綜上所述,在小鼠腹瀉模型小檗堿可通過上調(diào)NHE3而不是 NHE1的表達,進而增強腸管對鈉水的吸收,從而達到治療腹瀉的目的。但小檗堿具體通過何種機制上調(diào) NHE3的表達尚需進一步的研究。

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