新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科(石河子 832008)

李應(yīng)龍 丁國富 王勤章* 李令勛 倪 釗 王新敏

逼尿肌不穩(wěn)定(Detrusor instability,DI)又稱不穩(wěn)定膀胱(Unstable bladder,USB),是在膀胱充盈時,自發(fā)的或被誘發(fā)的不能被主動抑制的逼尿肌不自主收縮。是臨床最常見的膀胱尿道功能障礙之一,與尿頻、尿急、緊迫性尿失禁等多種癥狀的產(chǎn)生有關(guān),但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。 Cajal間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial cells of Cajal,ICCs)是存在于消化系統(tǒng)中,具有重要的起搏功能的一種特殊的間質(zhì)細(xì)胞,它作為胃腸電活動的起搏者,在胃腸蠕動中起著重要的作用。 1996年,Smet和Jonavicius首先發(fā)現(xiàn)了在豚鼠和人逼尿肌上,存在著與ICCs在形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)上類似的間質(zhì)細(xì)胞[1]。由于該類細(xì)胞是否在膀胱中發(fā)揮其在胃腸管一樣的功能尚有待進(jìn)一步證實(shí),故膀胱 ICCs被稱為膀胱 Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞或膀胱 ICCs樣細(xì)胞,以與胃腸管 ICCs相區(qū)別。近年來,有關(guān)膀胱 ICCs樣細(xì)胞的形態(tài)和功能研究表明,膀胱 ICCs樣細(xì)胞可能具有起搏功能,與 DI的發(fā)生關(guān)系密切[2～5]。我們采用熒光免疫組織化學(xué)[6],觀察膀胱逼尿肌中 ICCs樣細(xì)胞的分布,探討其與 DI的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)對象 健康雌性豚鼠 50只,購自昆明醫(yī)學(xué)院動物中心,體重 250～ 300g,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(40只)和對照組(10只),實(shí)驗(yàn)組行尿道結(jié)扎建立膀胱出口梗阻模型,對照組僅行尿道分離術(shù)而不作結(jié)扎,飼養(yǎng)6周后行充盈性膀胱測壓[7],確定 DI組 14只。測壓后飼養(yǎng) 3d,處死豚鼠,取出膀胱,小心剔除黏膜層,標(biāo)本經(jīng) 4%甲醛固定 20～ 40 min,4℃條件下 0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗過夜,OCT包埋,恒冷箱冰凍機(jī)切片,厚 50 μm,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 免疫組織化學(xué) 組織切片室溫下風(fēng)干 30min,25℃ 1%牛血清蛋白液孵育 30min,加入酪氨酸蛋白激酶受體 (KIT)單克 隆抗 體 (ACK2,1∶ 100,eBIOSCIENCE公司)4℃ 48h,異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗大鼠 IgG抗體(1∶40,DAKO公司)25℃ 60min,水溶性封片劑封片,熒光顯微鏡觀察,各步驟間用 0.01mol/L PBS漂洗 3次,每次 5min,加入一抗后所有步驟避光操作。對照實(shí)驗(yàn)以正常鼠血清代替一抗,或兔血清代替二抗,結(jié)果均為陰性。選取豚鼠腸壁為陽性對照,染色方法同上。每張切片取 4～5個視野,將數(shù)字化圖像儲存于計(jì)算機(jī),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行圖像分析。

3 半定量分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 圖片用 Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化,以 KIT陽性細(xì)胞占逼尿肌組織面積百分比為變量,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行 t檢驗(yàn),以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

以下結(jié)果均以豚鼠空腸壁環(huán)形平滑肌層中 KIT陽性細(xì)胞為陽性對照(見圖 1)。

1 ICCs樣細(xì)胞的形態(tài)與分布 KIT陽性的ICCs樣細(xì)胞在對照組和 DI組豚鼠膀胱逼尿肌組織中分布一致,它們的走向與逼尿肌肌束平行,主要都分布于逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束中(見圖 2～ 3)。兩組細(xì)胞形態(tài)基本一致,呈梭形雙極細(xì)胞,表現(xiàn)為以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個長突起 (見圖 2～ 3)。在逼尿肌組織中可見陽性著色的肥大細(xì)胞,呈圓形,無突起,與 ICCs樣細(xì)胞的形態(tài)截然不同(見圖 4)。

2 ICCs樣細(xì)胞的數(shù)量 DI組 KIT陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增多(見圖 2～ 3)。通過半定量分析顯示,DI組 KIT陽性細(xì)胞占逼尿肌組織面積的百分比(DI組 8.488%±3.440%)明顯大于對照組(3.324%±2.114%),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.01,兩組有極顯著性差異。

圖1 豚鼠空腸壁環(huán)形平滑肌層中 KIT陽性細(xì)胞為陽性對照(箭頭所示);KIT免疫熒光染色×200

圖2 對照組豚鼠逼尿肌中 KIT陽性細(xì)胞(箭頭所示)呈梭形雙極細(xì)胞,表現(xiàn)為以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個長突起。KIT陽性細(xì)胞走向與逼尿肌肌束平行,主要分布于逼尿肌肌束邊緣(細(xì)箭頭)和逼尿肌肌束中(粗箭頭);KIT免疫熒光染色×200

圖3 DI組豚鼠逼尿肌中 KIT陽性細(xì)胞形態(tài)與分布與對照組相似 (箭頭所示),數(shù)量較對照組明顯增多;KIT免疫熒光染色×200

圖4 逼尿肌組織中肥大細(xì)胞(箭頭所示),呈圓形,無突起,與 ICCs樣細(xì)胞的形態(tài)截然不同;KIT免疫熒光染色 ×200

討 論

逼尿肌具有和胃腸平滑肌相似的、不受神經(jīng)控制的自發(fā)性肌源性興奮性,其興奮起源和調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。 ICCs在胃腸管興奮起源、動力產(chǎn)生和功能調(diào)控方面的重要作用以及逼尿肌和胃腸管平滑肌相似的生理特性,讓我們聯(lián)想到該類細(xì)胞在膀胱中存在和發(fā)揮相似功能的可能性。近年來,隨著對膀胱 ICCs樣細(xì)胞形態(tài)和功能研究的深入,ICCs樣細(xì)胞對膀胱動力的關(guān)鍵性調(diào)控作用引起了研究者們極大的關(guān)注。Mc-Closkey等[2]對新鮮分離的 ICCs樣細(xì)胞采用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的 Ca2+濃度變化情況,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有自發(fā)性 Ca2+濃度波動,推測其在膀胱中可能具有起搏細(xì)胞樣活性。

我們曾在此之前嘗試過許多方法,如行膀胱組織石蠟切片及冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色,均未得到很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),對豚鼠膀胱組織采用組織冰凍切片,行 KIT免疫組織熒光染色的方法能較好地顯示出 KIT陽性的膀胱 ICCs樣細(xì)胞,是研究膀胱ICCs樣細(xì)胞的可靠方法。本研究發(fā)現(xiàn),對豚鼠膀胱組織采用組織冰凍切片,行 KIT免疫組織熒光染色的方法能較好地顯示出 KIT陽性的膀胱 ICCs樣細(xì)胞,是研究膀胱 ICCs樣細(xì)胞的可靠方法。本研究結(jié)果顯示的KIT陽性細(xì)胞主要分布于豚鼠逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束中,而國外報道主要分布于豚鼠逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束間結(jié)締組織中[8],這種差別除豚鼠種族的原因外,可能與標(biāo)本的處理,抗體的選擇以及方法有關(guān),需要更大規(guī)模的調(diào)查證實(shí)。在膀胱中,對 KIT陽性的細(xì)胞除 ICCs樣細(xì)胞外,還有肥大細(xì)胞,但肥大細(xì)胞胞體呈圓形,無突起,與 ICCs樣細(xì)胞極易區(qū)別。

與對照組相比,DI組逼尿肌中 ICCs樣細(xì)胞數(shù)量明顯增加,形態(tài)和分布上未見明顯變化。這與國外報道的膀胱過度活動癥患者逼尿肌中,ICCs樣細(xì)胞數(shù)量明顯增加的結(jié)果相似[9]。膀胱 ICCs樣細(xì)胞與神經(jīng)干和神經(jīng)節(jié)連接緊密[8],而 KIT受體抑制劑甲磺酸伊馬替尼可明顯抑制正常豚鼠和 DI患者離體膀胱逼尿肌肌條的自發(fā)興奮性,并可提高豚鼠膀胱的膀胱容量和膀胱順應(yīng)性[9,10],提示 ICCs樣細(xì)胞與膀胱逼尿肌興奮的起源和調(diào)控有密切的關(guān)系,可能就是膀胱的起博細(xì)胞。

綜上所述,DI逼尿肌中 ICCs樣細(xì)胞數(shù)量明顯增加,可能增加了逼尿肌自身興奮收縮性能,擾亂了神經(jīng)系統(tǒng)與逼尿肌間的信息傳遞,進(jìn)而導(dǎo)致了逼尿肌自發(fā)收縮活動增加,膀胱收縮功能發(fā)生紊亂。本研究結(jié)果表明膀胱中 ICCs樣細(xì)胞數(shù)量的增多,可能是引起 DI產(chǎn)生的原因之一,ICCs樣細(xì)胞可能就是理論上存在于膀胱的起博細(xì)胞。本研究結(jié)果為研究 DI發(fā)生機(jī)制及臨床治療膀胱功能障礙提供了新的依據(jù)。

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