嚴(yán)一紅 周 紅 周保成 文海平 許國(guó)瑩 周 芳 (江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,鎮(zhèn)江 212013)

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome,APS)是一種非器官特異性自身免疫性疾病,主要臨床表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性動(dòng)、靜脈血栓及習(xí)慣性流產(chǎn)[1]。APS患者血清中的高滴度抗磷脂抗體(Antiphospholipid antibody,APL)與其血栓形成密切相關(guān)。研究表明,β2糖蛋白 Ⅰ(beta-2-glycoproteinⅠ,β2GP Ⅰ)是APL的主要靶抗原,其與相應(yīng)抗體(anti-β2GPⅠ)形成復(fù)合物,在APS病理過程中發(fā)揮重要作用[2,3]。anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物能夠誘導(dǎo)血液?jiǎn)魏思?xì)胞表達(dá)組織因子(Tissue factor,TF),由TF引發(fā)的外源性凝血是APS血栓形成的主要原因之一[4,5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),anti-β2GPⅠ與其抗原β2GPⅠ交聯(lián)于細(xì)胞膜表面特異受體,經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)使細(xì)胞表達(dá)TF等活性分子,導(dǎo)致血液高凝[6]。近年來,有關(guān)細(xì)胞表面β2GPⅠ受體的研究及相關(guān)信號(hào)途徑的探討是APS研究的關(guān)鍵問題,其中Toll樣受體4(TLR4)的作用正受到關(guān)注。

TLR4是Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)家族成員之一,屬于Ⅰ型跨膜蛋白(TypeⅠtransmembrance protein),是病原微生物模式識(shí)別受體[7]。TLR4可以識(shí)別多種配體,其中最主要的是來自細(xì)菌脂多糖(LPS)。研究發(fā)現(xiàn),TLR4與其相應(yīng)配體結(jié)合后,迅速引起髓樣分化蛋白-2(Myeloid differentiation-2,MD-2)分子的分泌[8]。后者與TLR4的胞外區(qū)相偶聯(lián),形成TLR4/MD-2受體復(fù)合物,隨即活化其下游的接頭蛋白——髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)。MyD88接著招募下一個(gè)信號(hào)蛋白,最終激活核因子κ B(Nuclear factor-kappa B,NF-κ B)和有絲分裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路,導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。

本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物作用于單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞后,細(xì)胞TLR4表達(dá)水平上升,提示TLR4受體途徑在其中具有一定的作用。本文重點(diǎn)探討TLR4及其分泌蛋白MD-2、接頭蛋白 MyD88 在 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF表達(dá)中的作用,并采用紫杉醇抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明TLR4及相關(guān)信號(hào)蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人單核細(xì)胞株THP-1(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所),DMEM(Gibco公司),超級(jí)新生牛血清(杭州吉諾公司),兔抗人TLR4、MD-2多克隆抗體(eBioscience公司),MyD88抗體(Cell signaling公司),非特異性同型對(duì)照抗體——R-IgG(武漢博士德生物工程有限公司),Trizol(Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司),TF活性試劑盒(Assaypro公司),紫杉醇(同田生物技術(shù)有限公司),定量PCR試劑盒(杭州博日科技有限公司),ECL顯色試劑(Santa Cruz公司),LPS(Sigma公司),anti-β2GPⅠ抗體和β2GPⅠ(本實(shí)驗(yàn)室制備),CNBr-activatedsepharose-4B(Amersham公司),β2GPⅠ膠聯(lián)親和層析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel,本實(shí)驗(yàn)室制備),引物(設(shè)計(jì)采用primer primer 5.0,由上海生物工程有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的THP-1細(xì)胞,用DMEM 培養(yǎng)液(含10%新生牛血清,100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素),置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部的70%～80%時(shí),給細(xì)胞換液并傳代。取傳代5～10次、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 β2GPⅠ與THP-1細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合分析

利用CNBr-activated-Sepharose-4B自制β2GPⅠ膠聯(lián)親和層析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel)。采用 anti-β2GPⅠ/β2 GPⅠ復(fù)合物(濃度為 100 μ g/ml)與THP-1細(xì)胞(1×107)孵育6小時(shí),收集細(xì)胞,PBS洗滌3次后,加入1 ml細(xì)胞裂解液裂解,4℃10 629 r/min離心10分鐘后取上清,經(jīng)0.02 mol/L Tris-HCl透析過夜后上樣至β2GPⅠ-Affi-Gel柱,分別應(yīng)用0.03mol/L NaCl的Tris平衡液和0.35 mol/L NaCl的Tris洗脫液洗脫,各步驟均洗滌至流出液吸光度值接近0為止。將收集的樣本流出液、0.03 mol/L NaCl的Tris平衡收集液及0.35 mol/L NaCl的Tris洗脫收集液三份樣本經(jīng)過SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜,將膜用5%牛奶封閉1小時(shí)后,以抗TLR4抗體為一抗,37℃孵膜2小時(shí)。PBS洗滌3次后,再與相應(yīng)二抗37℃孵育1小時(shí),PBS洗滌3次后采用ECL顯色,并記錄結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 將THP-1細(xì)胞種入6孔板內(nèi)(2×106/孔),37℃、5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)后輕輕棄去培養(yǎng)液,換以1 ml無血清DMEM。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同刺激物處理細(xì)胞2小時(shí)。紫杉醇抑制試驗(yàn)則先將紫杉醇與細(xì)胞孵育1小時(shí)后,再以不同刺激物處理細(xì)胞2小時(shí)。收集細(xì)胞,加入1ml Trizol裂解,混勻后于室溫放置10分鐘充分裂解,按Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒要求操作,逆轉(zhuǎn)錄體系:總 RNA 1 μ g、OligodT 1 μ l、5 ×Buffer 4 μ l、dNTPs(10 mmol/L)2 μ l、RNase Inhibitor 1μ l、ReverTra Ace 1μ l,最后用ddH2O 補(bǔ)足至20 μ l。反應(yīng)條件:42℃20分鐘,99℃5分鐘,4℃5分鐘。將RNA及逆轉(zhuǎn)錄的cDNA分別于-70℃和-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細(xì)胞裂解物的制備 收集傳代3～10次的THP-1細(xì)胞,種植于6孔板內(nèi),濃度為2×106/孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后棄去上清,加入1 ml無血清DMEM,然后以相應(yīng)刺激物刺激6小時(shí)。紫杉醇抑制試驗(yàn)先將紫杉醇與細(xì)胞孵育1小時(shí)后再與相應(yīng)刺激物作用6小時(shí),收集細(xì)胞,加入適量細(xì)胞裂解液,于冰上裂解0.5小時(shí),期間每隔10分鐘劇烈震蕩一次,4℃10 629 r/min離心10分鐘后取上清,測(cè)定蛋白濃度,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè) 分別設(shè)計(jì)TLR4、MD-2、MyD88、TF、GAPDH 基因的 PCR引物序列(表 1),行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為:2×SYBR Mix 10 μ l,上下游引物各 0.5 μ l,TaqDNA Polymerase 0.12 μ l,最后用滅菌 ddH2O補(bǔ)足至 20 μ l。Real-time PCR循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5分鐘,一個(gè)循環(huán);94℃30秒,60℃(TLR4、MD-2、MyD88、TF)/56℃(GAPDH)30 秒,72℃30秒,35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。目的基因的相對(duì)表達(dá)水平=目的基因拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)。

1.2.6 Western 蛋白印跡分析 取收集的總蛋白30 μ g與樣本緩沖液作用,94℃變性3分鐘后以12%SDS-PAGE電泳分離蛋白,再以350 mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜;膜置于含有5%脫脂牛奶的TBS/T室溫封閉1小時(shí);再分別用相應(yīng)的兔抗人TLR4(1∶1 500)、兔抗人MD-2(1∶500)及兔抗人MyD88(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜,次日用TBS/T洗滌3次,15 min/次,采用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶500),37℃孵育1小時(shí),TBS/T洗滌3次,15min/次,ECL顯色系統(tǒng)定影顯色,觀察雜交條帶。

1.2.7 TF活性檢測(cè) 利用TF/Ⅶa復(fù)合物使因子Ⅹ轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨蜃英鷄,根據(jù)Ⅹa生成量來判定細(xì)胞TF的活性。測(cè)定標(biāo)本為細(xì)胞裂解物,嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。在96孔反應(yīng)板中加入50 μ l的樣品稀釋液和10 μ l的因子Ⅶ后,分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)定樣本10 μ l,以樣品稀釋液為空白,37℃反應(yīng)30分鐘后,加入因子Ⅹ。37℃反應(yīng)30分鐘后再加入Ⅹa的發(fā)色底物,于405 nm、37℃條件下測(cè)定吸光度值。吸光度值高低和樣品中TF活性呈正相關(guān),TF活性結(jié)果以pmol/L表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)以±s表示。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行成組資料的t檢驗(yàn)分析,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Anti-β2GPⅠ /β2GP Ⅰ誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞表達(dá)TF mRNA及活性 本研究組已證明anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物能夠誘導(dǎo)血液?jiǎn)魏思?xì)胞表達(dá)TF活性[3,5],此次觀察了單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞的情況。由圖1可見,anti-β2GP Ⅰ/β2GP Ⅰ復(fù)合物(100 μ g/ml)能夠顯著增加THP-1細(xì)胞的TF mRNA水平(圖1A),并增強(qiáng)細(xì)胞的TF活性(圖1B),與未加任何處理的THP-1細(xì)胞(Control)比較,差異顯著(P＜0.05);而非特異性同型對(duì)照抗體— —R-IgG/β2GPⅠ(100 μ g/ml)復(fù)合物則沒有此作用(圖1)。本實(shí)驗(yàn)以LPS(500 ng/ml)刺激細(xì)胞為陽性對(duì)照。

表 1 TLR4、MD-2、MyD88、TF和 GAPDH 基因引物序列Tab.1 Sequences of TLR4,MD-2,MyD88,TF and GAPDH gene primers

2.2 β2GPⅠ與THP-1細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合 本實(shí)驗(yàn)室自制的β2GPⅠ-Affi-Gel柱經(jīng)估算,β2GPⅠ蛋白偶聯(lián)率達(dá)85.8%。將與anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物孵育過的THP-1細(xì)胞,裂解后經(jīng)β2GPⅠ-Affi-Gel柱親和層析,再利用抗TLR4抗體對(duì)層析后的標(biāo)本進(jìn)行 Western 蛋白印跡分析。結(jié)果顯示:樣本流出液及0.03mol/L NaCl的Tris平衡收集液中沒有檢測(cè)到TLR4目的條帶,而經(jīng)0.35 mol/L NaCl的Tris洗脫液洗脫后,在100 kD處可檢測(cè)到清晰的TLR4目的條帶(圖2),表明 anti-β2GPⅠ/β2GP Ⅰ復(fù)合物能夠與細(xì)胞膜上TLR4結(jié)合。

2.3 Anti-β2GPⅠ/β2 GP Ⅰ增 強(qiáng) THP-1 細(xì) 胞 TLR4、MyD88、MD-2的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)同樣設(shè)立未處理THP-1細(xì)胞的空白對(duì)照(Control)及LPS刺激的陽性對(duì)照。結(jié)果顯示 :經(jīng)anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ(100 μ g/ml)刺激 2小時(shí) 后 ,THP-1細(xì)胞TLR4 、MyD88 、MD-2mRNA表達(dá)均顯著增加(圖3A),與空白比較差異顯著(P＜0.05)。另外, Western 蛋白印跡分析刺激6小時(shí)后相應(yīng)的蛋白水平,與未刺激的空白比較,觀察到TLR4、MyD88、MD-2蛋白表達(dá)也有明顯的增強(qiáng),條帶增粗,密度增厚(圖3B)。

圖1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞 TF mRNA(A)表達(dá)及TF活性(B)Fig.1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced THP-1 cells TF mRNA(A)expression and TF activity(B)

2.4 紫杉醇抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TLR4、MyD88、MD-2 的表達(dá) 將 1 μ mol/L 紫杉醇與THP-1細(xì)胞預(yù)孵育 1小時(shí)后,再以 anti-β2GPⅠ/β2GP Ⅰ 復(fù)合物(100 μ g/ml)刺激細(xì)胞,觀察 TLR4、MyD88、MD-2 mRNA和蛋白水平的變化 。圖4結(jié)果顯示,經(jīng)紫杉醇處理后,anti-β2GP Ⅰ/β2 GPⅠ復(fù)合物不能增加THP-1細(xì)胞的TLR4、MyD88及MD-2 mRNA的表達(dá)(圖4A),與對(duì)照比較無顯著差異(P＞0.05);并且,相應(yīng)的蛋白水平從條帶上觀察也無明顯增強(qiáng)(圖4B)。

圖2 β2GPⅠ與THP-1細(xì)胞相應(yīng)受體TLR4結(jié)合分析Fig.2 Analysis of β2GPⅠ binding with THP-1 cells-related receptor TLR4

圖 3 Anti-β2GP Ⅰ/β2GPⅠ 誘 導(dǎo) 的 THP-1 細(xì) 胞 TLR4、MyD88、MD-2 mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)Fig.3 Anti-β2G PⅠ/β2G PⅠ-induced THP-1 cells TLR4,MyD88,MD-2 mRNA(A)and protein(B)expression

圖4 紫杉醇抑制 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)的 THP-1細(xì)胞 TLR4、MyD88、MD-2 mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)Fig.4 Paclitaxel inhibits anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced THP-1 cells TLR4,MyD88,MD-2 mRNA(A)and protein(B)expression

圖5 紫杉醇抑制 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)的 THP-1細(xì)胞 TF mRNA表達(dá)(A)及 TF活性(B)Fig.5 Paclitaxel inhibits anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced THP-1cells TF mRNA(A)expression and TF activity(B)

2.5 紫杉醇抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF表達(dá) 上述結(jié)果表明紫杉醇能夠抑制TLR4及相關(guān)分子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察紫杉醇抑制TLR4表達(dá)以后,是否影響 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF的表達(dá)。結(jié)果顯示:經(jīng)紫杉醇預(yù)處理的THP-1細(xì)胞,anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激后,與Control相比,細(xì)胞的TF mRNA表達(dá)(圖5A)和TF活性(圖5B)均無明顯變化(P＞0.05),表明TLR4及其相關(guān)分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的過程中至關(guān)重要。

3 討論

Toll樣蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅,它是果蠅對(duì)抗病原微生物感染中的重要受體。接著Medzhitov[10]等發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)有與果蠅相似的Toll蛋白,并命名為Toll樣受體(TLRs)。至今在人類已發(fā)現(xiàn)11種TLRs(TLR1～TLR11),TLR4是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的人類Toll樣受體蛋白,廣泛分布于單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及肝臟、脾臟等組織,是人類天然免疫的重要受體。TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白,由胞外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三個(gè)部分組成,主要參與由LPS誘發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。最早發(fā)現(xiàn)LPS的識(shí)別受體是CD14,但由于CD14無跨膜結(jié)構(gòu),不能將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi),TLR4及MD-2的發(fā)現(xiàn)是對(duì)LPS認(rèn)識(shí)的突破性進(jìn)展。MD-2是一個(gè)小分子分泌蛋白,正常情況下,單核細(xì)胞僅有少量表達(dá),在LPS的刺激作用下,MD-2分泌增加,同時(shí)促進(jìn)TLR4向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移和表達(dá)。在對(duì)LPS的識(shí)別過程中,TLR4和MD-2以復(fù)合物的形式作為共同受體,缺一不可[11]。TLR4一旦活化,有兩條途徑參與TLRs的激活及后續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),主要區(qū)別在于其胞內(nèi)接頭蛋白的不同,由此分為MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。其中MyD88通過其羧基(C)端與TLR4胞內(nèi)區(qū)發(fā)生同源性相互作用,其氨基(N)端(又名死亡結(jié)構(gòu)域)又招募下一個(gè)信號(hào)蛋白,最終活化NF-κ B和MAPK信號(hào)通路,參與炎癥、腫瘤及其他多種疾病的病理過程[12]。

近年來的研究提示TLR4與APS病理機(jī)制密切相關(guān)[13],APL誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)TF可能涉及到TLR4。本研究組采用流式細(xì)胞分析,發(fā)現(xiàn)anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞后TLR4表達(dá)顯著增加(結(jié)果未顯示)。這一有趣的結(jié)果促使我們深入探討TLR4及相關(guān)信號(hào)分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF中的作用。我們首先明確了anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物對(duì)THP-1細(xì)胞TF表達(dá)的誘導(dǎo)作用(圖1)。然后,將anti-β2GPⅠ/β2GP Ⅰ復(fù)合物刺激過的THP-1細(xì)胞裂解物通過β2GPⅠ-Affi-Gel親和層析柱,利用抗TLR4抗體分析經(jīng)鹽洗脫液后樣本中是否含有TLR4。結(jié)果驗(yàn)證,細(xì)胞膜上TLR4能夠結(jié)合到 β2GPⅠ-Affi-Gel柱上, Western 蛋白印跡顯示洗脫液中有TLR4的反應(yīng)條帶(圖2所示)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞后,TLR4及其相關(guān)信號(hào)啟動(dòng)分子MD-2和MyD88的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),antiβ2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物能夠產(chǎn)生與LPS相同的刺激效應(yīng),顯著增加細(xì)胞表達(dá)TLR4、MD-2及MyD88 mRNA及蛋白的水平(圖3)。本小組前期研究表明,單核細(xì)胞表面的膜聯(lián)蛋白A2(AnnexinA2)可作為antiβ2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物的受體,介導(dǎo)復(fù)合物與細(xì)胞結(jié)合[14,15]。然而Annexin A2缺乏膜內(nèi)結(jié)構(gòu),不能將胞外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),TLR4可能與Annexin A2組成復(fù)合受體,參與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,本小組正在進(jìn)行這方面的深入研究。另外,研究表明在分子結(jié)構(gòu)上,β2GPⅠ與 TLR4的特異性配體——某些病毒或細(xì)菌的結(jié)構(gòu)存在相似性[16,17],因此,β2GPⅠ是否能直接刺激TLR4的表達(dá)并與其結(jié)合,從而引發(fā)后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),值得探討。總之,本研究表明TLR4及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物作用于細(xì)胞過程中擔(dān)當(dāng)重要角色。

為充分闡明TLR4及其信號(hào)分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)TF中的作用,本實(shí)驗(yàn)采用TLR4途徑抑制劑——紫杉醇,觀察對(duì)細(xì)胞表達(dá)上述分子及TF的影響。紫杉醇(Paclitaxel)是一種常見的抗癌藥,近年研究發(fā)現(xiàn),紫杉醇可以通過與MD-2結(jié)合,掩蓋TLR4配體的受體結(jié)合位點(diǎn)而起到抑制TLR4信號(hào)通路的作用[18,19]。本研究利用紫杉醇的這一特性,觀察紫杉醇是否干預(yù)anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ對(duì)THP-1細(xì)胞的作用。結(jié)果證明,紫杉醇不僅抑制了 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ 復(fù)合物誘導(dǎo)的TLR4、MD-2表達(dá),也抑制了TLR4接頭蛋白 MyD88的表達(dá),同時(shí)也干預(yù)了細(xì)胞TF的表達(dá)。必須強(qiáng)調(diào)的是,在用紫杉醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中,我們通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇合適濃度及作用時(shí)間,排除了紫杉醇本身對(duì)細(xì)胞的毒性影響。

綜上所述,本研究進(jìn)一步明確了anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激單核細(xì)胞株THP-1表達(dá)TF的作用;證明細(xì)胞膜TLR4 能夠與β2GPⅠ結(jié)合;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物通過TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,最終促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)TF,從而參與APS血栓形成。紫杉醇可以干預(yù)這一過程,提示可作為APS血栓形成的預(yù)防及治療藥物應(yīng)用。

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