賀菽嘉 肖紹文羅 彬 藍秀萬林文珍林永達 謝小薰

(廣西醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室,南寧530021)

MAGE-D4a融合蛋白的原核表達、純化及鑒定①

賀菽嘉 肖紹文②羅 彬 藍秀萬③林文珍③林永達 謝小薰

(廣西醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室,南寧530021)

目的:構(gòu)建腫瘤相關(guān)抗原MAGE-D4a的原核重組體系,表達、純化融合蛋白。方法:PCR法從膠質(zhì)瘤組織cDNA中擴增MAGE-D4a基因全長編碼區(qū),連接入原核表達載體pMAL-c2,篩選、鑒定陽性克隆并測序。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)誘導表達,表達產(chǎn)物經(jīng)Amylose Resin親和層析分離純化,并且對純化的融合蛋白進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果:成功擴增了MAGE-D4a基因;重組質(zhì)粒在Rosetta大腸桿菌中誘導表達出MBP/MAGE-D4a融合蛋白;優(yōu)化了MAGE-D4a原核表達體系的最適條件;蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果顯示表達的基因重組蛋白與目的蛋白相符。結(jié)論:獲得了高效表達、可溶性的MAGE-D4a重組蛋白,為抗體的制備及血清學分析奠定了基礎(chǔ)。

黑色素瘤相關(guān)抗原-D4a;原核表達;純化;融合蛋白

腫瘤細胞表達的自身特異性抗原可以通過與MHC分子結(jié)合而激活CT L,還能誘導機體產(chǎn)生體液免疫反應,是腫瘤免疫治療及早期診斷的重要分子標記物。篩選和鑒定有價值的腫瘤抗原是發(fā)展腫瘤新型治療手段的重要前提。2001年Sasaki等[1]采用基因表達系列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)技術(shù)鑒定出黑色素瘤相關(guān)抗原(Melanoma-associate antigen,MAGE)家族的新成員MAGE-D4基因,并且對該基因的染色體定位、結(jié)構(gòu)和mRNA表達特性進行了分析,結(jié)果提示MAGE-D4有可能成為具備潛在應用前景的腫瘤相關(guān)抗原。為了進一步了解MAGE-D4在不同組織中的表達譜以及引起機體免疫反應的情況,本研究以pMAL-c2質(zhì)粒為載體,構(gòu)建MAGE-D4a原核重組表達體系,在大腸桿菌Rosetta(DE3)中表達出可溶形式的目的蛋白,并對親和層析純化后的蛋白進行了質(zhì)譜鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 DH5α菌株、pMAL-c2質(zhì)粒及Amylose Resin親和層析填料為New England Biolabs公司產(chǎn)品;Rosetta(DE3)菌株為Novagen公司產(chǎn)品;限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ、XmnⅠ、PstⅠ和T4 DNA連接酶為MBI公司產(chǎn)品;PrimeSTARTMHS DNA polymerase為TaKaRa公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒為BIOER公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MAGE-D4a編碼區(qū)稀有密碼子分析 利用網(wǎng)絡(luò)資源Codon Usage Database(http://www.kazusa. or.jp/codon/)和 Codon Usage Analyzer(http://www. bioinformatics.org/codon/cgi-bin/codon.cgi)對MAGED4a基因cDNA ORF進行分析。

1.2.4 MAGE-D4a在大腸桿菌中的誘導表達 將測序正確的MAGE-D4a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞(42℃熱休克法),接種單菌落于含0.2%葡萄糖、100μg/ml氨芐青霉素及34μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)液,37℃劇烈振蕩至OD600為0.5～0.7,取1 ml菌液作為誘導前對照,加入IPTG終濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.5、2.0 mmol/L,30℃誘導表達1、2、3、4、5、6、7、8小時及過夜。收集菌體進行8%SDS-PAGE電泳,觀察不同IPTG濃度和誘導時間對目的蛋白表達量的影響。

1.2.5 MAGE-D4a融合蛋白的純化與質(zhì)譜分析取200 ml表達的菌液,4℃10 000 r/min離心10分鐘,每克菌體沉淀加入3 ml過柱平衡液(20 mmol/L Tris-HCl,200 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,10 mmol/ Lβ-巰基乙醇)和 50 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)8μl,反復凍融三次,冰浴超聲裂解細菌,4℃10 000 r/min離心20分鐘,分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE,檢查目的蛋白的可溶性。將上清液結(jié)合Amylose Resin親和層析柱,用12倍柱床體積的過柱平衡液洗去非特異結(jié)合的雜蛋白,含10 mmol/L麥芽糖的洗脫緩沖液洗脫MBP/MAGE-D4a融合蛋白,收集洗脫液,測定OD280,SDS-PAGE電泳鑒定純度,用ABI 4700質(zhì)譜儀進行MALDI-TOF-TOF MS/MS蛋白質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

2.1 稀有密碼子分析結(jié)果 MAGE-D4a基因編碼區(qū)稀有密碼子的分布情況見圖1,稀有密碼子的出現(xiàn)頻率高達10.52%,數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表1。

圖1 MAGE-D4a基因稀有密碼子分布情況Fig.1 Rare codon distribution of MAGE-D4a gene

2.2 MAGE-D4a重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 通過高保真DNA聚合酶進行PCR擴增,獲得與預期2 235 bp大小一致的MAGE-D4a基因全長編碼區(qū),見圖2。挑取白色轉(zhuǎn)化菌落,提取質(zhì)粒,分別用質(zhì)粒通用引物及基因特異性引物擴增,結(jié)果與預測相符,證實MAGE-D4a已經(jīng)插入pMAL-c2質(zhì)粒的malE基因下游的多克隆位點。PstⅠ酶切重組質(zhì)粒獲得1 002 bp和7 850 bp兩個片段,表明目的基因為正向克隆,見圖3。將DNA測序結(jié)果進行Blast比對,MAGE-D4a基因序列與GeneBank公布的完全一致(AB040527)。

2.3 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達 以大腸桿菌Rosetta為宿主菌,加入IPTG誘導后,在分子量約140 kD處出現(xiàn)一條明顯增粗的條帶,比預測的MBP/MAGE-D4a融合蛋白理論分子量(124 kD)稍大,見圖4。目的蛋白表達量的高低不僅與菌液的生長狀態(tài)、誘導時間有關(guān),還受到IPTG加入時機及IPTG濃度的影響。結(jié)果顯示,在細菌進入對數(shù)生長期后,加入終濃度為0.1～0.7 mmol/L的IPTG,目的蛋白的表達量沒有明顯差異,而當IPTG濃度>0.7 mmol/L時蛋白表達量反而下降;在0.3 mmol/L的IPTG誘導下,30℃振蕩培養(yǎng)6小時時融合蛋白的表達量最高,約占菌體總蛋白的47.7%;超聲破菌后的上清液和沉淀同時進行SDS-PAGE分析表明,融合蛋白部分以可溶性的形式存在,部分以不溶性的包涵體形式存在。

表1 MAGE-D4a稀有密碼子分析Tab.1 Rare codon analysis of MAGE-D4a gene

圖2 PCR擴增MAGE-D4a基因電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoretogram of MAGE-D4a gene

圖3 pMAL-c2/MAGE-D4a重組質(zhì)粒的限制性酶切分析Fig.3 Restriction enzyme analysis of pMAL-c2/MAGE-D4a recombinant plasmid

圖4 pMAL-c2/MAGE-D4a重組質(zhì)粒的誘導表達及純化Fig.4 The induction expression and purification of pMAL-c2/ MAGE-D4a

圖5 MAGE-D4a融合蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.5 MALDI-TOF-TOF mass spectrometry analysis of MAGE-D4a protein

圖6 MAGE-D4a蛋白質(zhì)序列Fig.6 Amino acid sequence of MAGE-D4a protein

2.4 融合蛋白的親和層析和質(zhì)譜鑒定 將超聲裂解后的表達菌上清進行Amylose Resin親和層析,得到純化的融合蛋白,見圖4。為了確認純化得到的蛋白是MBP/MAGE-D4a目的蛋白,切下SDS-PAGE凝膠上的相應條帶,進行MALDI-TOF-TOF MS/MS分析,通過肽段同源性分析證實表達的基因工程蛋白為MAGE-D4a,見圖5。圖6為MAGE-D4a蛋白全長氨基酸序列,其中加粗下劃線的肽段為MS/MS分析中與MAGE-D4a完全匹配的部分。

3 討論

MAGE-D4基因定位于人染色體 Xp11,全長7 643 bp,由13個外顯子組成,轉(zhuǎn)錄過程中外顯子選擇性剪接形成MAGE-D4 a、b、c 3個變異體。啟動子區(qū)域的分析表明在轉(zhuǎn)錄起始位點附近有CpG島的存在。MAGE-D4a和D4b蛋白在421～600氨基酸區(qū)域具有MAGE家族同源結(jié)構(gòu)域(MAGE homology domain,MHD)[2]。Sasaki等[3]通過定量 RT-PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)母細胞瘤組織中MAGE-D4的表達為正常星形膠質(zhì)細胞的2.6～15倍。Northern blot法檢測了14種(各1例)正常組織,除腦和卵巢外均未發(fā)現(xiàn)MAGE-D4 mRNA的表達。最近,該研究小組報道MAGE-D4在非小細胞肺癌中的表達水平高于正常肺組織,并且分化程度差的肺癌常呈MAGE-D4高表達,這說明MAGE-D4可能在腫瘤細胞的增殖中發(fā)揮作用[4]。Kramer等[5]從腎癌實體瘤組織中鑒定了來源于MAGE-D4的第一個MHCⅠ配體:NIG DEALIGRW。這些研究結(jié)果初步顯示MAGE-D4很可能是一個腫瘤相關(guān)的抗原基因。

pMAL-c2質(zhì)粒的多克隆位點上游攜帶有大腸桿菌malE基因,可編碼產(chǎn)生42 kD的麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP),采用可誘導的tac強啟動子和malE翻譯起始信號獲得克隆基因的高效表達,N端帶有MBP-tag的重組蛋白可通過多糖樹脂親和層析進一步純化,多數(shù)情況下不會影響表達產(chǎn)物的免疫原性及活性。本研究在構(gòu)建MAGE-D4a原核重組質(zhì)粒及表達純化融合蛋白時,獲得了以下的寶貴經(jīng)驗:首先,在基因克隆方面,由于MAGE-D4a mRNA編碼區(qū)GC含量(59.8%)較高的特點,即使在4%DMSO的條件下, Taq DNA聚合酶擴增目的條帶的效率仍然非常低,因而正式擴增時采用了PrimeSTARTMHS DNA聚合酶(TaKaRa),該酶具有極強的3′→5′核酸外切酶活性而顯示出超群的校正功能,即使對GC rich的模板也能進行高效率、高保真的擴增;選擇XmnⅠ和XbaⅠ酶切進行平粘端連接,這不僅有利于目的基因的定向克隆,而且還可通過Factor Xa等蛋白酶的切割得到非融合的完整的目的蛋白。其次,將測序正確的重組質(zhì)粒在DH5α、TB1等常規(guī)菌株中表達時,發(fā)現(xiàn)融合蛋白的表達量非常之低,經(jīng)分析,原因可能是MAGE-D4a含有較多的大腸桿菌稀有密碼子(10.52%),稀有密碼子成簇出現(xiàn)或聚集在一起使蛋白翻譯過程中tRNA不能正常乙?；?導致核糖體的運動受阻,造成蛋白表達困難、氨基酸錯配或翻譯提前終止。Rosetta(DE3)是一種攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌,可以補充大腸桿菌七種稀有密碼子(AUA,CCC,GG A,CGG,CUA,AG A和AGG)對應的tRNA,顯著提高真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。實驗結(jié)果顯示,在 IPTG的誘導下,MAGE-D4a在Rosetta重組菌中實現(xiàn)了高效的表達,并且部分以可溶性形式存在。第三,SDS-PAGE鑒定重組蛋白時,BandScan軟件推算融合蛋白分子量約140 kD,比預測的理論分子量124 kD(MBP 42 kD+MAGE-D4a 82 kD)稍大,考慮到在原核表達體系中并不存在糖基化等翻譯后修飾,推測這可能是由于Mage-D4a富含脯氨酸(7.02%)引起蛋白空間結(jié)構(gòu)異常,在電泳時實際遷移率變慢所致。為了進一步確認,對純化的融合蛋白進行MALDI-TOF-TOF MS/MS分析,證實表達的基因工程蛋白為MAGE-D4a。

目前有關(guān)MAGE-D4基因的研究非常有限,表達特性的檢測多限于mRNA水平[6-8]。MAGE-D4蛋白能否有效地引起機體免疫應答,其生物學功能及與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預后的關(guān)系如何,能否成為腫瘤基因和免疫治療的分子靶向,這些問題值得進一步的深入分析。本研究首次成功構(gòu)建了pMAL-c2/MAGE-D4a原核表達體系,在Rosetta宿主菌中高效表達出可溶性的MAGE-D4a全長蛋白,并通過親和層析得到了純度較高的融合蛋白,可用于今后血清學的檢測以及抗體的制備,為評估MAGE-D4在腫瘤輔助診斷及治療監(jiān)測中的應用前景奠定基礎(chǔ)。

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2 Kawano Y,Sasaki M,Nakahira Ket al.Structural characterization and chromosomal localization of the MAGE-E1 gene[J].Gene,2001;277(1-2):129-137.

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5 Kramer B F,Schoor O,Kruger Tet al.MAGED4-expression in renal cell carcinoma and identificationof an HLA-A＊25-restricted MHC class I ligand from solid tumor tissue[J].Cancer Biol Ther,2005;4(9):943-948.

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[收稿2009-11-24 修回2010-02-04]

(編輯 張曉舟)

Prokaryotic expression,purification and identification of MAGE-D4a

HE Shu-Jia,XIAO Shao-Wen,LUO Bin,LAN Xiu-Wan,LIN Wen-Zhen,LIN Yong-Da,XIE Xiao-Xun.Department of Histology and Embryology,Guangxi Medical University,Nanning530021,China

Objective:T o construct tumor associated antigen MAGE-D4a prokaryotic recombination systemfor expression and purification of the fusion protein.Methods:PCR technique was used to amplify MAGE-D4a of the full-length encoding sequence from human glioma sample,which was cloned into prokaryotic expression plasmid pMAL-c2.Positive clones were selected,identified,sequenced,and then transformed into E.coli Roseetta.After induced by IPTG,expressing products were purified with Amylose Resin affinitive chromatography and identified by mass spectrum.Results:The MAGE-D4a gene was obtained successfully.E.coli Roseetta strains which harbored the recombinant plasmid could express MBP/MAGE-D4a fusion protein.The inducing conditions of prokaryotic expression were optimized.The expressing protein was really identical to MAGE-D4a protein by mass spectrometry analysis.Conclusion:The highly efficient expression and soluble protein was manufactured,which could provide essential materials for further research of MAGE-D4a.

MAGE-D4a;Prokaryotic expression;Purification;Fusion protein

R739.4 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)05-0432-05

①本文受國家自然科學基金(30760055)、廣西省自然科學基金(桂科自0728148及0832144)、廣西高發(fā)疾病研究創(chuàng)新性團隊基金(No.桂教人[2007-59]號)和廣西大型儀器協(xié)作共用網(wǎng)(499-2007-078及666-2008-079)資助

②廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,南寧530021

③廣西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室,南寧530021

賀菽嘉(1976年-),女,在讀博士,主要從事腫瘤分子生物學及腫瘤免疫學研究,E-mail:hshj-306@yahoo.com.cn;

及指導教師:謝小薰(1958年-),女,博士,教授,博士生導師,主要從事腫瘤分子生物學及腫瘤免疫學研究,E-mail:xiexiaoxun@yahoo.com。