張子寧 尚 紅 姜擁軍 王亞男 張 韓曉旭 施萬(wàn)英 李革飛 金 鑫

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng) 110001)

目前,艾滋病仍無(wú)治愈的方法,疫苗的研發(fā)多以失敗告終,原因之一在于未能闡明病毒與人體免疫系統(tǒng)相互作用的復(fù)雜性。HIV感染后,90%的HIV感染者經(jīng)8～10年進(jìn)入艾滋病期,疾病呈現(xiàn)典型進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。但5%～10%的HIV感染者,雖然感染時(shí)間已超過(guò)10年,未經(jīng)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(Highly active anti-retroviral therapy,HAART)治療,CD4+T細(xì)胞數(shù)卻仍為正常,免疫功能接近于正常狀態(tài),被稱為長(zhǎng)期不進(jìn)展者(Long-term non progressors,LTNP)[1]。目前長(zhǎng)期不進(jìn)展者的保護(hù)機(jī)制仍未徹底闡明,對(duì)這一人群的研究對(duì)于明確HIV的致病機(jī)制及人體抗感染免疫應(yīng)答至關(guān)重要,可為艾滋病的疫苗設(shè)計(jì)及治療提供重要靶點(diǎn)。

HIV感染需要細(xì)胞表達(dá)CD4分子及趨化因子受體,趨化因子受體或其配體的基因突變CCR2-641、SDF1-3′A和CCR5A32可保護(hù)宿主,延緩病程的發(fā)展[1]。國(guó)外及我們的前期研究顯示,CD4+T細(xì)胞趨化因子受體的表達(dá)水平同樣與艾滋病疾病進(jìn)程相關(guān),感染HIV后CD4+T細(xì)胞趨化因子受體CCR5表達(dá)水平增加,而CXCR4表達(dá)水平下降[2,3],但外周血CD4+T細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平是否與HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展?fàn)顟B(tài)有關(guān)尚無(wú)報(bào)道。靜息細(xì)胞主要表達(dá)CXCR4,活化細(xì)胞則主要表達(dá)CCR5,我國(guó)經(jīng)采供血HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者趨化因子受體表達(dá)是否與免疫活化狀態(tài)有關(guān),目前尚未見(jiàn)報(bào)道。我國(guó)經(jīng)采供血傳播的感染者與經(jīng)性、吸毒等感染者相比,感染時(shí)間相對(duì)明確,可準(zhǔn)確定義長(zhǎng)期不進(jìn)展者。本研究通過(guò)對(duì)河南、吉林等地經(jīng)采供血感染,病毒亞型均為B′的44例長(zhǎng)期不進(jìn)展者進(jìn)行了研究,并與相同感染途徑的無(wú)癥狀HIV感染者、艾滋病人進(jìn)行對(duì)比,對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)與疾病進(jìn)展的關(guān)系進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 165例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者來(lái)自中國(guó)河南、吉林、遼寧省,感染途徑均為既往有償采全血和/或單采血漿,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室病毒序列分析病毒亞型均為B′,未接受抗病毒治療。依據(jù)感染時(shí)間、CD4+T細(xì)胞數(shù)量及臨床癥狀將HIV感染者進(jìn)行分期:長(zhǎng)期不進(jìn)展組(LTNP)感染時(shí)間大于10年,CD4+T細(xì)胞＞500個(gè)/μ l,無(wú)艾滋病指征性癥狀;無(wú)癥狀HIV感染組(HIV)CD4+T細(xì)胞介于200～500個(gè)/μ l之間,無(wú)艾滋病指征性癥狀;艾滋病組(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),CD4+T細(xì)胞＜200個(gè)/μ l或出現(xiàn)艾滋病指征性癥狀。依據(jù)上述分期標(biāo)準(zhǔn),本研究病例中長(zhǎng)期不進(jìn)展組43例,HIV組82例,AIDS組35例。未暴露于HIV的健康對(duì)照40例。四組年齡、性別經(jīng)One Way ANOVA或卡方檢驗(yàn)比較后均無(wú)差異。研究對(duì)象一般狀況及基本病毒學(xué)、免疫學(xué)狀況見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司,包括流式細(xì)胞儀(FACSCalibur),EDTA抗凝管,絕對(duì)計(jì)數(shù)管,TriTEST CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP抗體,單克隆抗體:FITC標(biāo)記的抗CD4和抗 CD8單抗、PE標(biāo)記的抗 CD38、抗CCR5和抗CXCR4單抗及PerCP標(biāo)記的抗CD3、抗HLA-DR單抗。

1.3 CD4+T細(xì)胞趨化因子受體及淋巴細(xì)胞活化水平檢測(cè) FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)研究對(duì)象全血T淋巴細(xì)胞活化(HLA-DR、CD38)及CCR5、CXCR4表達(dá)情況。應(yīng)用以下FITC/PE/PerCP標(biāo)記單抗組合進(jìn)行染色:CD4/CCR5/CD3;CD4/CXCR4/CD3;CD4/CD38/HLA-DR;CD8/CD38/HLA-DR。室溫孵育 30分鐘,加入溶血素3ml,室溫孵育8分鐘,1200 r/min離心5分鐘,棄上清。加入2 ml PBS懸浮,室溫,1 200 r/min離心5分鐘,洗滌兩次。加入1%多聚甲醛的 PBS 200 μ l懸浮,FACS CELLQuest軟件進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4 CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值及病毒載量檢測(cè) CD4絕對(duì)值采用單平臺(tái)法應(yīng)用BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀MultiSET軟件檢測(cè)。病毒載量采用RT-PCR方法,用美國(guó)Roche公司的COBAS AMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x測(cè)定病毒載量。

表1 HIV/AIDS患者一般狀況及基本病毒學(xué)、免疫學(xué)狀況(±s)Tab.1 Clinical and immunological characteristics of included subjects(±s)

表1 HIV/AIDS患者一般狀況及基本病毒學(xué)、免疫學(xué)狀況(±s)Tab.1 Clinical and immunological characteristics of included subjects(±s)

Groups LTNP(n=43) HIV(n=82) AIDS(n=35) NC(n=16)Age(years) 41.5±7.0 42.7±7.8 44.1±9.4 42.4±8.6 Males 62.8% 52.4% 51.4% 43.8%CD4 count,cells/μ l 675±155 357±80 148±89 794±247 Plasma HIV RNA,log10 copies/ml 3.20±1.13 4.11±0.81 4.56±0.90 N/A N/A%CD4+CCR5+T cell 11.92±7.01 19.50±11.53 25.25±15.88 10.96±11.67%CD4+CXCR4+T cell 70.57±18.12 70.43±21.66 73.98±16.88 69.46±13.87%CD4+HLA-DR+T cell 13.34±8.06 15.78±11.37 35.33±17.71 9.38±6.98%CD8+HLA-DR+T cell 36.52±15.55 34.71±17.81 54.75±16.38 25.14±15.18%CD4+CD38+T cell 72.49±10.30 73.21±10.13 72.89±15.86 59.98±14.55%CD8+CD38+T cell 77.30±15.42 85.18±9.88 90.01±7.03 56.80±15.00

1.5 流式細(xì)胞儀分析 用于三色熒光標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的激發(fā)光為氬離子激光488 nm譜線,使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定淋巴細(xì)胞群,再分別以CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞為門,分析CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面活化分子HLA-DR、CD38的表達(dá)。CCR5、CXCR4表達(dá):用FSC及SSC 確定淋巴細(xì)胞群,以CD3+T淋巴細(xì)胞為門,分析CD4+T淋巴細(xì)胞表面CCR5、CXCR4的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS13.0軟件包對(duì)資料進(jìn)行方差分析,全部數(shù)據(jù)用±s表示。各組間數(shù)據(jù)的比較采用ONE-ANOVA方法比較,用Spearman相關(guān)分析趨化因子受體CCR5、CXCR4表達(dá)與病毒載量、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量、T淋巴細(xì)胞活化(HLA-DR、CD38)的相關(guān)性。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T淋巴細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平 用流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)HIV感染者及健康對(duì)照趨化因子受體表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)LTNP組CD4+T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)明顯低于HIV組及AIDS組(P＜0.01),與健康對(duì)照無(wú)顯著差異;CD4+T細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá) LTNP組、HIV組、AIDS組無(wú)顯著差異。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,LTNP組CD4+T細(xì)胞CCR5表達(dá)水平要低于典型進(jìn)展的HIV及AIDS組,維持正常水平。

圖1 HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T淋巴細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平Fig.1 Chemokine receptor expression on CD4+T cells in HIV infected long term nonprogressors

2.2 HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者T淋巴細(xì)胞活化水平

淋巴細(xì)胞活化可影響趨化因子受體表達(dá)水平,我們對(duì)HIV感染者淋巴細(xì)胞活化水平進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)LTNP組 HLA、CD38在 CD4、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)低于HIV組及AIDS組,高于健康對(duì)照,其中除CD38在CD4+T細(xì)胞的表達(dá)外,其余指標(biāo)LTNP組均顯著低于AIDS組(P＜0.05);除HLA在CD4+T細(xì)胞的表達(dá)外,其余指標(biāo) LTNP組均顯著高于健康對(duì)照(P＜0.05);LTNP組與HIV組各活化指標(biāo)間無(wú)顯著差異,數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。結(jié)果表明,感染HIV后,盡管LTNP組免疫活化水平較健康對(duì)照升高,仍低于HIV及AIDS組。

2.3 HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞、病毒載量及淋巴細(xì)胞活化的相關(guān)性 為探討趨化因子受體表達(dá)是否與疾病進(jìn)展及免疫活化水平相關(guān),我們對(duì)上述指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示 CD4+T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.498,P＜0.05),與病毒載量無(wú)顯著相關(guān)性。CXCR4的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞數(shù)量、病毒載量無(wú)顯著相關(guān)性。CD4+T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)與HLA、CD38在CD4、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平顯著正相關(guān)(P＜0.001;HLACD4:r=0.428,HLACD8:r=0.266,CD38CD8:r=0.389),CD4+T細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)與HLA在CD4、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01;HLACD4:r=-0.268,HLACD8:r=-0.254)。結(jié)果表明,CD4+T細(xì)胞CCR5表達(dá)與疾病進(jìn)展關(guān)系密切,其表達(dá)水平的變化與CD4+T細(xì)胞數(shù)量及免疫活化水平密切相關(guān)。

3 討論

上世紀(jì)80年代及90年代早期,我國(guó)部分地區(qū)經(jīng)非法單采血漿等途徑造成艾滋病病毒在供血(賣血漿)員中的傳播。截至目前,陳舊獻(xiàn)血員中的多數(shù)感染者已進(jìn)入發(fā)病期,但流行病學(xué)調(diào)查顯示,部分感染者感染時(shí)間已超過(guò)10年,CD4+T細(xì)胞仍大于500個(gè)/μ l,成為HIV感染疾病長(zhǎng)期不進(jìn)展者。對(duì)這部分人群免疫學(xué)等因素的深入研究有助于明確其抗病毒的保護(hù)性因素,為HIV的疫苗設(shè)計(jì)及治療提供線索。

趨化因子受體與配體結(jié)合后,可以引起粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的定向遷移,對(duì)白細(xì)胞的活性及其功能的發(fā)揮有重要影響[4]。1996年,Feng等[5]發(fā)現(xiàn)部分趨化因子受體可作為HIV感染細(xì)胞的輔助受體,使其成為艾滋病防治的新靶點(diǎn)。HIV感染早期的病毒多應(yīng)用趨化因子受體CCR5感染CD4+T細(xì)胞,晚期多應(yīng)用CXCR4受體或兩個(gè)受體均可應(yīng)用,趨化因子受體的表達(dá)水平可通過(guò)影響HIV對(duì)靶細(xì)胞的易感性及致病能力等影響疾病進(jìn)程[6]。CCR5和CXCR4作為主要的輔助受體,其表達(dá)水平、基因型等在決定CD4+T細(xì)胞易感性中發(fā)揮了重要作用[7]。以往研究顯示,HIV感染后 CD4+T細(xì)胞CCR5表達(dá)升高,CXCR4表達(dá)降低[2],我們的前期研究也證實(shí),我國(guó)HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)增高[3],但CD4+T細(xì)胞趨化因子受體在長(zhǎng)期不進(jìn)展者中的表達(dá)情況目前尚無(wú)報(bào)道。我們對(duì)經(jīng)血HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者的研究中發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)水平明顯低于HIV組及AIDS組,與健康對(duì)照并無(wú)顯著差異,表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著負(fù)相關(guān),提示靶細(xì)胞低水平的CCR5表達(dá)與疾病長(zhǎng)期不進(jìn)展?fàn)顟B(tài)相關(guān)。國(guó)外研究顯示,CD4+T細(xì)胞表面CCR5的密度越高,病毒載量越高,如細(xì)胞表面CCR5數(shù)量低于1萬(wàn)個(gè),則該細(xì)胞對(duì)HIV-1的易感性明顯降低[8],我們觀察到的長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T細(xì)胞CCR5表達(dá)水平低可能通過(guò)降低靶細(xì)胞對(duì)病毒的易感性從而延緩疾病進(jìn)展。我們并未發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T細(xì)胞CXCR4表達(dá)與典型進(jìn)展者的差別,前期研究也未觀察到典型進(jìn)展者與健康對(duì)照這一指標(biāo)的差異[3],提示靶細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)在評(píng)價(jià)HIV感染者免疫狀態(tài)及預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展等方面具有更重要作用。

國(guó)外研究顯示,細(xì)胞活化水平是影響趨化因子受體表達(dá)的重要因素之一[2,7]。CCR5主要表達(dá)在活化的淋巴細(xì)胞表面,CXCR4主要表達(dá)在靜息細(xì)胞表面。淋巴細(xì)胞活化可誘導(dǎo)表面活化標(biāo)志物表達(dá),其中HLA-DR作為經(jīng)典的活化標(biāo)志物,其增高與T細(xì)胞功能缺失相關(guān),且隨HIV疾病進(jìn)展增高[9],CD38則表達(dá)在早期造血細(xì)胞表面,細(xì)胞成熟后消失,活化后再次表達(dá),是HIV感染疾病進(jìn)展的重要標(biāo)志之一[10]。我們應(yīng)用HLA-DR及CD38對(duì)淋巴細(xì)胞活化水平進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期不進(jìn)展者淋巴細(xì)胞活化水平高于健康對(duì)照,但明顯低于典型進(jìn)展者,CD4+T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)與T細(xì)胞活化水平顯著正相關(guān),焦艷梅等[11]亦發(fā)現(xiàn)中國(guó)HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T細(xì)胞活化程度沒(méi)有明顯增高,提示長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T細(xì)胞CCR5表達(dá)水平較低與其低水平的細(xì)胞活化狀態(tài)有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)與活化水平顯著負(fù)相關(guān),提示隨著HIV感染細(xì)胞活化水平的增加,靜息細(xì)胞數(shù)量的下降將導(dǎo)致CXCR4表達(dá)水平的下降。

綜上,我國(guó)經(jīng)采供血感染HIV的長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD4+T細(xì)胞表面趨化因子受體CCR5表達(dá)維持較低水平,與低水平的淋巴細(xì)胞活化相關(guān),為探討長(zhǎng)期不進(jìn)展者的保護(hù)機(jī)制,評(píng)價(jià)感染者免疫狀態(tài)及預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展提供了有益數(shù)據(jù)。

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