宋 麗 金呈強(qiáng) 劉 仿 杜寧超 肖 紅 (廣東醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室,湛江524023)

CD4+CD25+Foxp3+T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulation T cell,Tr細(xì)胞)是維持機(jī)體免疫耐受的重要調(diào)控者,在自身免疫病中的作用已引起關(guān)注。急性特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患兒外周血中Tr細(xì)胞數(shù)量的減少及相關(guān)細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)含量的降低,與急性ITP患兒的細(xì)胞免疫失調(diào)有關(guān)。而IL-2是Th1類(lèi)細(xì)胞因子,IL-2能否促進(jìn)或抑制Tr細(xì)胞的增殖尚未見(jiàn)報(bào)道。為探討ITP患兒Tr細(xì)胞數(shù)量受細(xì)胞因子IL-2的影響狀況,我們用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法分析患兒外周血中Tr細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-2的變化。

1 材料及方法

1.1 研究對(duì)象 35例急性ITP患兒系廣東醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和附屬湛江中心醫(yī)院住院病人,急性ITP患兒均符合急性ITP診斷標(biāo)準(zhǔn),正常對(duì)照為30例健康體檢者,詳細(xì)情況見(jiàn)表1。

1.2 試劑和儀器 PerCp-抗人CD3 mAb,FITC-抗人CD4 mAb和APC-Cy7-抗人CD8 mAb,流式細(xì)胞檢測(cè)試劑均購(gòu)自BD公司。鼠抗人IL-2mAb(mAHuIL-2)為Biosource公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品(型號(hào):FACSCanto),酶聯(lián)儀為 Biotek公司ELX800型。

1.3 方法

1.3.1 外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞檢測(cè) 取未刺激的外周肝素抗凝全血50μl后加入10μl的CD4-FITC與CD25-APC cocktail,并于4℃下避光孵育30分鐘以標(biāo)記CD4+CD25+T細(xì)胞;經(jīng)溶血洗滌后使用1 ml Fixatior/Perm緩沖液穿膜45分鐘,而后用洗滌緩沖液洗滌后加入1μl正常鼠血清于4℃封閉15分鐘,之后直接加入 10μl PE-抗人 Foxp3 mAb,于4℃避光孵育30分鐘。經(jīng)洗滌緩沖液洗滌2次后用300μl染色緩沖液重懸并上FACSCanto流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2 IL-2的檢測(cè) 患兒和健康兒童肝素抗凝血5 ml,室溫靜置 30分鐘后,離心分離血漿凍存于-70℃。同批用ELISA法分別測(cè)IL-2的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)均經(jīng)SAS 8.22統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用±s表示,兩變量的相關(guān)程度用直線(xiàn)相關(guān)分析法,以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 急性ITP患兒及正常對(duì)照兒童組外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量及IL-2的檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表2、3。ITP患兒外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞顯著低于對(duì)照組(t=2.19,P＜0.05),CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在總CD4+T細(xì)胞中所占比例也低于對(duì)照組(χ2=74.08,P＜0.05),急性 ITP組IL-2含量明顯低于對(duì)照組[(45.62±9.35)pg/ml VS(28.38±13.87)pg/ml,t=9.05,P＜0.01)]。

表1 急性ITP組和正常對(duì)照組一般資料比較Tab.1 The contrast data of acute ITP with normal group

表2 急性ITP組與對(duì)照組外周血T細(xì)胞亞群及IL-2比較(±s)Tab.2 The contrast of T cell′s subpopulation and IL-2 in blood between acute ITP and contrast group(±s)

表2 急性ITP組與對(duì)照組外周血T細(xì)胞亞群及IL-2比較(±s)Tab.2 The contrast of T cell′s subpopulation and IL-2 in blood between acute ITP and contrast group(±s)

Note:1)P＜0.05.

Groups n CD4+T cell(%)Tr cell/CD4+T cell IL-2(pg/ml)Acute ITP 35 27.37±5.591)0.11±0.041)28.38±13.871)Control group 30 35.32±2.27 0.15±0.02 45.62±9.35

表3 急性ITP組與對(duì)照組外周血T細(xì)胞亞群及Foxp3的比較Tab.3 The contrast of T cell′s subpopulation and Foxp3 in blood between acute ITP and contrast groups

圖1 急性ITP患者血漿IL-2含量與Tr細(xì)胞的相關(guān)性分析Fig 1 The pertinency analysis between IL-2 and Tr cell in plasama of ITP

2.2 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞與細(xì)胞因子IL-2的相關(guān)性 急性ITP組外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞的比例與IL-2的水平呈正相關(guān)(r值為0.86,P＜0.05)見(jiàn)圖1。

3 討論

急性特發(fā)性血小板減少性紫癜是兒童常見(jiàn)的一種免疫性出血性疾病,發(fā)病機(jī)制不明,迄今尚無(wú)特異而有效的治療方法。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞免疫在ITP的發(fā)病機(jī)制中扮演著極其重要的角色。ITP患者體內(nèi)可檢測(cè)到自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞,這些T細(xì)胞能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)血小板表面糖蛋白的自身抗體[1],CD4+自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異常激活是ITP發(fā)病機(jī)制的始動(dòng)環(huán)節(jié)之一[2]。另外發(fā)現(xiàn)急性ITP患者中Th1細(xì)胞增多、Th2細(xì)胞減少,反映Th1細(xì)胞功能的細(xì)胞因子(如IL-2、INF-γ、IL-6和血清可溶性IL-2受體sIL-2R)血漿水平明顯升高[3],而與Th2細(xì)胞功能密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4和IL-6水平則明顯降低,證實(shí)ITP是一種Th1優(yōu)勢(shì)的自身免疫病[4,5]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞為一種自然發(fā)生的、胸腺來(lái)源的T細(xì)胞,是一種具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群,該細(xì)胞能抑制自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞的活化和增殖,以及自身抗體的產(chǎn)生,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持機(jī)體自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。Tr細(xì)胞的數(shù)目減少或功能失調(diào)均可引起自身免疫性疾病[6]。最新的研究表明,在急性和慢性難治復(fù)發(fā)性的ITP患者外周血中,調(diào)節(jié)性細(xì)胞的數(shù)量顯著低于緩解的患者和健康志愿者,且該細(xì)胞的抑制功能也明顯出現(xiàn)障礙,證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目減少和功能缺陷可能為ITP免疫紊亂的參與機(jī)制之一[7,8]。另外,急性ITP患兒外周血中Tr細(xì)胞數(shù)量減少,CD4+CD25+T細(xì)胞相關(guān)性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β的表達(dá)水平也降低,IL-7則對(duì)Tr細(xì)胞數(shù)量的變化產(chǎn)生一定的影響[9,10]。Tr細(xì)胞活化后分泌大量的IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子,其功能通過(guò)這些抑制性細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)[11]。

IL-2主要由T細(xì)胞或T細(xì)胞系產(chǎn)生。目前關(guān)于IL-2的生物學(xué)作用大都是體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。IL-2具有以下生物學(xué)作用:①Th和Tc細(xì)胞都是IL-2的反應(yīng)細(xì)胞:IL-2對(duì)靜止T細(xì)胞作用較弱。胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞經(jīng)抗原、有絲分裂原或同種異體抗原刺激活化后有在IL-2存在的條件下進(jìn)入S期,維持細(xì)胞的增殖。IL-2可刺激T細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR,CD71)、胰島素受體、MHCⅡ 類(lèi)抗原的表達(dá),并產(chǎn)生多種淋巴因子如 IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-β及 CSF等。②誘導(dǎo)CTL、NK和LAK等多種殺傷細(xì)胞的分化和效應(yīng)功能,并誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子。IL-2可增強(qiáng)CTL細(xì)胞穿孔素(perforin)基因的表達(dá)。③直接作用于B細(xì)胞,促進(jìn)其增殖、分化和Ig分泌。已發(fā)現(xiàn)IL-2R也可存在于活化的B細(xì)胞中,IL-2對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用除通過(guò)刺激T細(xì)胞分泌B細(xì)胞增殖和分化因子外,還可能有直接的調(diào)節(jié)作用。④活化巨噬細(xì)胞。但I(xiàn)L-2對(duì)Tr細(xì)胞的作用至今尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

以上研究表明,ITP患兒外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞顯著低于對(duì)照組(t=2.19,P＜0.05),CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在總CD4+T細(xì)胞中所占比例也低于對(duì)照組(χ2=74.08,P＜0.05),急性ITP組IL-2含量明顯低于對(duì)照組[(45.62±9.35)pg/ml VS(28.38±13.87)pg/ml,t=9.05,P＜0.01)]。他們含量的減少使有效的免疫抑制作用降低,導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活增多、凋亡減少,促進(jìn)了血小板的破壞。

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