劉 明 吳啟南 邵 瑩
南京中醫(yī)藥大學,江蘇 南京 210046
淡竹葉(Herba Lophatheri)為禾本科(Gramineae)植物淡竹葉(Lophatherumgracile Brongn.)的干燥莖葉。本品性寒,味甘、淡,歸心、胃、小腸經,有清熱除煩,利尿的功效,用于熱病煩渴,小便赤澀淋痛,口舌生瘡等癥[1]。淡竹葉中含有大量的黃酮、多糖、內酯、葉綠素、氨基酸、維生素和微量元素等成分,其中黃酮類化合物具有較高的生物活性。大孔吸附樹脂是近十年來發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑,其穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨特、不受無機物存在的影響、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長、成本較低。近年來被廣泛用于中藥成分的精制純化。本實驗以淡竹葉乙醇提取液為對象,通過大孔樹脂的篩選實驗,探索淡竹葉總黃酮純化精制的最佳工藝。
HH-S型水浴鍋;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵;DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱;AY220型電子分析天平;旋轉蒸發(fā)儀;日本島津UV-2401型紫外分光光度計。
蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號100080-200707。淡竹葉購自浙江省磐安縣新渥陳仙芬中藥材購銷站,產地浙江,批號:20090308;醫(yī)用酒精;其余試劑均為分析純。
采用硝酸鋁一亞硝酸鈉比色法,以蘆丁為標準品,在507nm處測定。得蘆丁濃度C(mg/mL)與吸光度A的回歸方程式:A=11.905C+0.0044,R2=0.9994。線性范圍:8~48ug/ml。
取淡竹葉約100g,石油醚脫脂,18倍量75%乙醇回流提取1.0h[3],減壓濃縮至無醇味,加入適量蒸餾水稀釋,靜置過夜,3000rpm離心,上清液置250ml量瓶中,加蒸餾水至刻度,作為供試液備用。移取供試液0.25ml置25ml量瓶中,按標準曲線制備項下的方法,自“各加60%乙醇溶液使成6.0ml”起,依法測定吸光度,測得供試液中總黃酮含量為3.6689mg/ml。移取10ml供試液置蒸發(fā)皿中水浴揮干,恒重,測得供試液中總黃酮含量為135.3841mg/g。
2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理
以乙醇濕法上柱。用95%乙醇溶液在柱上流動清洗,不時檢出流出液至乙醇液與水混合(1:5)不呈白色混濁為止,然后以大量蒸餾水洗去乙醇至無醇味。
2.3.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附考察
取預處理的7種不同型號的樹脂20ml分別置100ml量瓶中,精密移取5ml提取液,加水稀釋至50ml,時時振搖,放置18h。濾過,濾液測定吸光度。濾渣中加入85%乙醇50ml,時時振搖,放置18h。濾過,濾液測定吸光度。移取50ml濾液置蒸發(fā)皿中水浴揮干,恒重。平行測定2份。按式(1)(2)(3)計算得表1。
表1 靜態(tài)吸附時不同樹脂對總黃酮的影響
2.3.3 大孔樹脂動態(tài)吸附考察
取預處理的樹脂20ml裝柱(15mm*300mm),精密移取5ml提取液上樣,靜置1h。用蒸餾水洗至無色,洗液測定其吸光度。加入85%乙醇溶液洗脫至無色,洗脫液測定吸光度。移取25ml洗脫液置蒸發(fā)皿中水浴揮干,恒重。平行測定2份。按式(1)(2)(3)計算得表2。
表2 動態(tài)吸附時不同樹脂對總黃酮的影響
從表2和表3可以看出HP-20和D-101型大孔吸附樹脂吸附率和解吸率均較高,從節(jié)約成本角度,故選擇D-101大孔吸附樹脂進行進一步試驗。
2.4.1 乙醇溶液洗脫雜質的體積分數(shù)梯度考察
取預處理樹脂20ml裝柱,精密移取2ml提取液上樣,靜置1h。依次用水、10%、15%、20%、30%的乙醇溶液以2ml/min速度洗脫。洗脫液測定吸光度,移取15ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干,恒重。平行測定2份。按式(3)計算得圖1。
圖1 低濃度乙醇梯度洗脫總黃酮含量變化
由圖1可知,20%乙醇溶液洗脫液中總黃酮含量增加明顯,因此,選用15%乙醇溶液作為雜質的洗脫溶液。
2.4.2 洗脫液體積分數(shù)考察
取預處理樹脂20ml裝柱,精密移取2ml提取液上樣,靜置1h。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質。分別用40%、50%、60%、75%、95%的乙醇溶液以2ml/min速度洗脫。洗脫液測定吸光度,精密移取40ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干,恒重。平行測定2份。按式(3)計算得圖2。由圖2可知,50%乙醇溶液洗脫黃酮的含量最高,因此,選用50%乙醇溶液為洗脫劑。
圖2 不同濃度乙醇洗脫總黃酮含量變化
2.4.3 上柱靜態(tài)吸附時間考察
取預處理樹脂20ml裝柱,精密移取2ml提取液上樣,分別靜置15min、30min、60min、90min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質。用50%乙醇溶液洗脫,洗脫液測定吸光度。洗脫速度均為2ml/min。精密移取25ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干,恒重。平行測定2份。按式(1)(2)(3)計算得表3。由表3可知,60min處的吸附率和解吸率均較高,且其黃酮含量也較高,綜合考慮選擇60min為上柱靜態(tài)吸附時間。
表3 上柱靜態(tài)吸附時間對總黃酮含量的影響
2.4.4 洗脫液體積考察
取預處理樹脂10ml裝柱,精密移取4ml提取液上樣,靜置60min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質,50%乙醇溶液洗脫。洗脫速度均為2ml/min。每1~2個樹脂體積收集一份洗脫液,精密移取測定吸光度。實驗結果:5倍量蒸餾水,5倍量15%乙醇溶液,6倍量50%乙醇溶液洗液中總黃酮含量均分別接近于零。因此,可確定上述條件為最佳洗脫體積。
2.4.5 樹脂重復上樣次數(shù)考察
取預處理樹脂10ml裝柱,精密移取3ml提取液上樣,靜置60min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質,50%乙醇溶液洗脫。洗脫速度均為2ml/min。洗脫液測定吸光度,精密移取一定體積水浴蒸干,恒重。平行測定2份。用95%乙醇溶液洗滌至與水1:5混合不渾濁,用蒸餾水洗至無醇味。重復上樣操作4次。4次實驗結果顯示:吸附率和解吸率均無明顯變化,而總黃酮含量不降反升,其中原因有待進一步實驗。說明該型號樹脂重復使用率較高。
2.4.6 驗證試驗
取預處理樹脂10ml裝柱,精密移取3ml提取液上樣,靜置60min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質,50%乙醇溶液洗脫。洗脫速度均為2ml/min。洗脫液吸光度,精密移取10ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干,恒重。平行測定2份。測得吸附率為81.58%,解吸率為78.08%,總黃酮含量為315.42mg/g。
通過大孔樹脂的動態(tài)和靜態(tài)吸附考察,確定D-101型大孔吸附樹脂比較適合于淡竹葉總黃酮的精制純化。工藝條件為:上柱保持60min,2ml/min速度洗脫,5倍量水、5倍量15%乙醇溶液洗脫雜質、6倍量50%乙醇溶液洗脫。總黃酮的純度由原來的135.38mg/g上升至315.42mg/g。其結果經驗證試驗確認該條件可行,可以作為工業(yè)生產的參考工藝條件。
[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上海科學技術出版社,1977:2253-2254.
[2]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005:附錄28.
[3]宋秋燁,陳梅,吳啟南.淡竹葉總黃酮提取工藝研究[A].中國中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(3):14.