閆麗萍, 肖和平, 鄭瑞娟, 胡忠義, 樂 軍, 景玲杰

為了解結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐氧氟沙星臨床分離株gyrA基因突變與氟喹諾酮類藥物接觸史的關(guān)系,我們隨機(jī)篩選20株耐氧氟沙星的MTB臨床分離株行g(shù)yrA基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining regions,QRDR)序列測(cè)定,并調(diào)查這20株菌株的氟喹諾酮類藥物接觸史,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、材料

(一)MTB臨床分離株 2007年8月—2008年5月自上海市肺科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本分離、篩選出的耐氧氟沙星菌株,共20株,其中3株嚴(yán)重耐多藥(extensive-drug resistant,XDR),14株耐多藥(multi-drug resistant,MDR),1株多耐藥(poly-drug resistant,PDR),2株單耐氧氟沙星;H37Rv為試驗(yàn)對(duì)照用標(biāo)準(zhǔn)MTB菌株。

(二)抗菌藥物 鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇(均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品)、卷曲霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)、阿米卡星(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)和氧氟沙星(日本第一制藥株式會(huì)社)。

(三)培養(yǎng)基 PNB鑒別培養(yǎng)基、TCH鑒別培養(yǎng)基、改良7H9液體培養(yǎng)基。

二 、方法

(一)痰標(biāo)本MTB的分離、培養(yǎng)與鑒定 參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[1]。

(二)MTB的藥物試驗(yàn) 應(yīng)用BACTEC-960法檢測(cè)搜集的MTB臨床分離株對(duì)鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、卷曲霉素、阿米卡星和氧氟沙星的敏感性,根據(jù)BACTEC-960的操作手冊(cè),上述藥物所采用的濃 度 分別 為 ：1.0、0.1、1.0、5.0、1.0、2.5、2.0 mg/L,耐藥百分率大于1%則認(rèn)為受試菌對(duì)該藥物耐藥。

(三)H37Rv和耐氧氟沙星的MTB臨床分離株DNA提取與gyrA目的片段285 bp的擴(kuò)增、測(cè)序采用經(jīng)典的酚∶氯仿∶異戊醇法提取M TB全染色體DNA作為模版,基因擴(kuò)增在美國(guó)ABI2720 themo cycler PCR儀上進(jìn)行,引物序列為 P1 5'-CAG CTA CAT CGA CTA TGC GA-3'、P2 5'-GGG CTT CGG TGT ACC TCA T-3'。熱循環(huán)為94℃預(yù)變性4 min,然后按94℃1 min,60℃1 min,72℃1 min,循環(huán)40個(gè)周期,進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳(見圖1)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)乙醇純化后與引物P1和四色熒光標(biāo)記試劑(美國(guó)PE公司提供)混勻,按94℃1 min,55℃2 min,72℃4 min,循環(huán) 30個(gè)周期。在美國(guó)ABI3130XL型 genetic analyzer測(cè)序儀上測(cè)序(見圖2)。

結(jié) 果

H37Rv gyrA的QRDR測(cè)得序列與美國(guó)國(guó)立生物信息中心核酸數(shù)據(jù)庫已登錄的H37Rv株序列完全一致[2]。與H37Rv株序列的差異比較顯示20株臨床株的gyrA第95位密碼子均為ACC(H37Rv為AGC),為天然的多態(tài)現(xiàn)象[3]。18株存在有義突變,突變率為90%。其中2株第91位密碼子由TCG(絲氨酸)→CCG(脯氨酸),3株第90位密碼子由CCG(脯氨酸)→GTG(纈氨酸),10株第94位密碼子由GAC(天冬氨酸)→GGC(甘氨酸),2株第94位密碼子由GAC(天冬氨酸)→GCC(丙氨酸),1株第94位密碼子由GAC(天冬氨酸)→GTC(纈氨酸),其中以第94位密碼子的GAC(天冬氨酸)→GGC(甘氨酸)最為多見。

20株菌株的耐藥類型及既往氟喹諾酮類藥物應(yīng)用情況：既往未應(yīng)用過氟喹諾酮類藥物6例,均為MDR(其中2例初治,2例初治復(fù)發(fā),2例初治失敗)。2例曾在結(jié)核確診前應(yīng)用氟喹諾酮類藥物經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療1周患者,為單耐氧氟沙星(均為初治病例)。12例曾聯(lián)合應(yīng)用氟喹諾酮類藥物抗結(jié)核治療(1例為初治復(fù)發(fā),11例為多次治療失敗或復(fù)發(fā))患者,其中4例為XDR,7例為MDR,1例為PDR,見表1。20株MTB臨床分離株的耐藥譜見表2。

表1 不同F(xiàn)Qs接觸史的菌株gyrA的QRDR突變情況Table 1.QRDR mutations in gyrA of strains with different fluoroquinolones exposure history

表2 20株M TB臨床分離株的耐藥譜Table 2.Antibiotic resistant pattern of 20 clinical isolates of M.tuberculosis

討 論

氟喹諾酮類藥物主要通過抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶A(gyrase A)亞單位與DNA的結(jié)合,從而抑制結(jié)核菌DNA的復(fù)制與表達(dá),達(dá)到對(duì)M TB的殺滅作用[4]。gyrA是DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位的編碼基因,它的突變導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物無法與DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位結(jié)合,使MTB對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥[5]。本次實(shí)驗(yàn)的20株耐氧氟沙星MTB臨床株中共18株發(fā)現(xiàn)了有義突變,分別在第90例、91和94位密碼子上。未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的第88位[6]及74位[7]密碼子的突變,也未發(fā)現(xiàn)在同一株MTB上存在gyrA雙突變的情況[8]。本實(shí)驗(yàn)中有2株氧氟沙星耐藥株(10%)未發(fā)現(xiàn)gyrA突變,提示gyrA突變不是MTB耐氟喹諾酮類藥物唯一的機(jī)制。Kocagoz等[8]曾對(duì)未發(fā)現(xiàn) gyrA突變的菌株行g(shù)yrB檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了gyrB上第495位密碼子的突變。另外還有研究者提出泵蛋白對(duì)藥物的泵出作用[9]及細(xì)胞外膜對(duì)藥物的通透性降低[10]、細(xì)菌適應(yīng)藥物環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)制(如毒素-抗毒素系統(tǒng))[11]均可導(dǎo)致MTB對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥。最近,研究人員又在MTB中發(fā)現(xiàn)了一種能夠模擬DNA的蛋白質(zhì)MfpA[12],其表達(dá)使M TB對(duì)環(huán)丙沙星和司帕沙星產(chǎn)生耐藥,這可能是解釋氟喹諾酮耐藥的新機(jī)制。而本次實(shí)驗(yàn)中的2株無gyrA突變的氧氟沙星耐藥株對(duì)氧氟沙星的耐藥機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步的研究。但通過本實(shí)驗(yàn)可以明確的是gyrA突變是MTB對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制,且以其第90、91和94位密碼子的有義突變?yōu)橹鳌?/p>

關(guān)于氟喹諾酮類藥物誘發(fā)gyrA突變的時(shí)間折點(diǎn)問題目前的報(bào)道則更少。在本次研究中有2例初治患者僅于肺結(jié)核確診前接受1星期的氟喹諾酮類藥物經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療,確診后的首次藥敏試驗(yàn)即出現(xiàn)了單獨(dú)對(duì)氧氟沙星的耐藥及MTB gyrA的突變。由此看來極有可能單一應(yīng)用氟喹諾酮類藥物1周即可產(chǎn)生誘發(fā)gyrA的突變。但由于本次實(shí)驗(yàn)未收集到這2例患者應(yīng)用氟喹諾酮類藥物前的菌株,故此結(jié)論暫時(shí)還不能成立,但仍建議臨床醫(yī)師在結(jié)核病不能完全排除時(shí)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療應(yīng)避免使用氟喹諾酮類藥物。

本次研究還發(fā)現(xiàn)6例未應(yīng)用過氟喹諾酮類藥物的患者對(duì)氧氟沙星耐藥,且這6株均為MDR菌株。臨床病例調(diào)查發(fā)現(xiàn)這6例患者均為初治或首次復(fù)治患者,故考慮這些患者很可能是感染了耐氧氟沙星的MDR菌株。其中5株也仍存在gyrA突變,提示gyrA突變具有一定的穩(wěn)定性,在停止接觸氟喹諾酮類藥物后并持續(xù)傳代的過程中不易恢復(fù)敏感性。

通過本次實(shí)驗(yàn),我們得到以下啟示：gyrA基因突變是MTB對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一;gyrA基因的有義突變主要發(fā)生在第90、91和94位密碼子上。

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