李 穎, 楊 帆

一些臨床重要病原菌耐藥性的迅速增長(zhǎng)對(duì)抗感染治療構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,尋找細(xì)菌耐藥性增長(zhǎng)的原因及相應(yīng)防治措施成為當(dāng)務(wù)之急。目前認(rèn)為細(xì)菌耐藥性的傳播主要取決于病原菌(細(xì)菌本身的適應(yīng)性)、抗菌藥物(抗生素選擇壓力)和宿主(免疫力)3個(gè)因素的相互作用[1-2]。眾多研究表明細(xì)菌耐藥性的增長(zhǎng)與抗生素的選擇壓力有關(guān),但過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間的研究更多關(guān)注抗菌藥物的抗菌活性和細(xì)菌耐藥機(jī)制。近年來(lái)對(duì)于細(xì)菌耐藥性與其適應(yīng)性關(guān)系的研究為分析細(xì)菌耐藥性增長(zhǎng)的原因和探討如何降低耐藥性提供了新的視角,成為感染性疾病領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

適應(yīng)性(fitness)一般是指細(xì)菌為了生存與繁殖而調(diào)節(jié)自身代謝以適應(yīng)環(huán)境條件(如溫度、pH、滲透壓、抗生素等)的能力[3]。病原體的適應(yīng)性包含以下要素：在感染宿主和環(huán)境中不同菌株的繁殖(競(jìng)爭(zhēng))的相對(duì)效率;在宿主間的傳播能力;被感染宿主清除的情況[4]。本文主要就細(xì)菌的耐藥性與適應(yīng)性的關(guān)系作一綜述。

一、耐藥菌株的適應(yīng)性代價(jià)

有臨床和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)證實(shí),肺炎鏈球菌在對(duì)青霉素的敏感性和其菌株毒力之間存在相關(guān)性。Ho等[5]測(cè)定了181株肺炎鏈球菌菌株的藥敏結(jié)果,血流感染分離株中青霉素耐藥肺炎鏈球菌(PRSP)占33.3%,明顯低于其他部位分離株P(guān)RSP比率(73.8%,P＜0.01)。而在免疫功能健全的小鼠體內(nèi),接種野生型(wild)耐藥肺炎鏈球菌并不能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性肺炎[6]。Azoulay-Dupuis等[7]研究了122株肺炎鏈球菌臨床株,其中32株毒力株均對(duì)青霉素敏感,而41株對(duì)青霉素耐藥或敏感性下降的菌株均無(wú)毒力,結(jié)果顯示侵襲性肺炎鏈球菌大部分是青霉素敏感的,非侵襲性菌株大多數(shù)是青霉素不敏感的。

在觀察到耐藥細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖能力和致病力可能較敏感細(xì)菌低的現(xiàn)象后,國(guó)外很多學(xué)者進(jìn)行了許多有關(guān)細(xì)菌耐藥性與適應(yīng)性關(guān)系的研究(表1)。例如T rzcinski等[18]把肺炎鏈球菌青霉素敏感株,和插入青霉素結(jié)合蛋白基因的同源青霉素耐藥株同時(shí)接種于幼鼠鼻腔,并在其后4～5 d通過(guò)鼻腔沖洗液觀察兩者數(shù)量比值的變化,結(jié)果青霉素耐藥株在幼鼠上呼吸道定植力與敏感株相比隨著青霉素結(jié)合蛋白耐藥基因的表達(dá)數(shù)目增加而降低。比較腹腔內(nèi)接種青霉素敏感株和插入pbp2b、pbpx基因的同源青霉素耐藥株的小鼠的半數(shù)致死量(LD50),結(jié)果顯示耐藥株的LD50[分別為(6.0±0.6)和(6.7±0.3)log10CFU/小鼠]比敏感株[(2.0±0.6)log10CFU/小鼠]高,耐藥株毒力較敏感株顯著下降[19]。Gillespie等[30]推測(cè)PRSP株適應(yīng)性降低的主要原因可能是耐藥性菌株改變了細(xì)胞壁組成,由此導(dǎo)致的細(xì)胞壁合成所需的酶的底物、活性和親和力的變化增加了青霉素耐藥株的代謝負(fù)擔(dān)。適應(yīng)性降低的現(xiàn)象同樣見(jiàn)于喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥耐藥肺炎鏈球菌菌株[20-23]。

對(duì)其他細(xì)菌的研究也都顯示細(xì)菌獲得耐藥性突變后可引起其在體外或動(dòng)物體內(nèi)適應(yīng)性降低的結(jié)果。如體外誘導(dǎo)的rpoB基因突變耐利福平結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC9360),與其同源敏感株共同孵育后計(jì)算兩者繁殖世代的比值,觀察到突變耐藥株的世代數(shù)較同源敏感株少,也就是說(shuō)前者的體外競(jìng)爭(zhēng)繁殖能力較后者低[15]。另外有2項(xiàng)關(guān)于鼠傷寒沙門菌的研究顯示,由于rpsL、rpoB和gyrA基因突變而分別對(duì)鏈霉素、利福平和萘啶酸耐藥的鼠傷寒沙門菌的大部分(6株/7株)對(duì)小鼠無(wú)毒力[8],而由于rpsL基因的核苷酸置換AAA42→AAC而對(duì)鏈霉素產(chǎn)生耐藥性的鼠傷寒沙門菌,核糖體蛋白S12的氨基酸置換(K42N)引起核糖體校對(duì)率(rate of ribosomal proofreading)的上升,從而使得蛋白合成和細(xì)菌生長(zhǎng)速度減慢,細(xì)菌毒力降低[9]。Kanai等[24]在研究中發(fā)現(xiàn),分離自同一患者分別對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥(23SrRNA基因突變)和敏感的幽門螺桿菌株,在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)未表現(xiàn)出生長(zhǎng)速率的顯著性差異,當(dāng)混合培養(yǎng)時(shí),隨著連續(xù)傳代,耐藥株與敏感株菌落數(shù)量的比值逐漸減小,提示耐藥株在適應(yīng)性上有所降低。一項(xiàng)通過(guò)測(cè)定耐喹諾酮類藥物銅綠假單胞菌的體外生長(zhǎng)速率的研究結(jié)果顯示,前者的生長(zhǎng)速率較其同源敏感株低[25]。Sánchez等[26]的研究表明,2株體外選擇的多重耐藥銅綠假單胞菌突變株(nalB和nfxB)在水中的生存力,產(chǎn)蛋白酶和菌株毒力均較敏感株有所下降,推測(cè)可能是由于外排泵耐藥機(jī)制不僅泵出了抗生素,也泵出了大量代謝產(chǎn)物,增加了菌株的代謝負(fù)擔(dān)。

表1 染色體靶位突變引起的耐藥性相關(guān)適應(yīng)性代價(jià)Table 1.The biological cost of resistance conferred by target-altering chromosomal mutations

除了染色體靶位的突變,腸桿菌科細(xì)菌和其他革蘭陰性菌的耐藥性常由質(zhì)粒介導(dǎo)。也有許多研究報(bào)道了與攜帶耐藥質(zhì)粒相關(guān)的適應(yīng)性代價(jià),Lee等[31]的研究證實(shí)攜帶含有TcR(四環(huán)素耐藥)基因質(zhì)粒pBR322的大腸埃希菌體外生長(zhǎng)速率降低。Lenski等[32]分析與染色體靶位突變引起的細(xì)菌適應(yīng)性下降機(jī)制不同的是,攜帶耐藥性相關(guān)質(zhì)粒而導(dǎo)致適應(yīng)性降低的原因可能是質(zhì)粒在缺乏抗生素選擇壓力下不穩(wěn)定狀態(tài)所造成的,這也就使得不攜帶耐藥質(zhì)粒的敏感菌株生長(zhǎng)繁殖更多。

這些研究提示細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性常常改變了細(xì)菌的核糖體、DNA旋轉(zhuǎn)酶、RNA聚合酶、細(xì)胞壁等重要結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)速度、定植能力和毒力等的下降,即細(xì)菌耐藥性的獲得需要付出適應(yīng)性代價(jià)(fitness cost)[33]。因此,耐藥菌株的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)可能僅表現(xiàn)在存在抗生素選擇壓力時(shí),當(dāng)無(wú)抗菌藥選擇壓力時(shí)其適應(yīng)性反而可能較敏感株低。

二、適應(yīng)性代價(jià)的補(bǔ)償

多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí)耐藥會(huì)引起適應(yīng)性代價(jià),但也有研究觀察到一些無(wú)顯著適應(yīng)性代價(jià)的耐藥突變(表1)。如Bj?rkman等[10]的研究發(fā)現(xiàn),rpsL基因突變導(dǎo)致對(duì)鏈霉素耐藥的鼠傷寒沙門菌中部分菌株毒力并無(wú)明顯降低,在這些菌株同時(shí)發(fā)現(xiàn)了rpsD或rpsE基因突變。一項(xiàng)通過(guò)測(cè)定體外生長(zhǎng)速率評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)莫匹羅星耐藥和糖肽類中介的金葡菌(GISA-2)、莫匹羅星敏感和糖肽類中介的金葡菌(GISA-1)和Mu50菌株生長(zhǎng)情況的研究結(jié)果表明異亮氨酰-tRNA合成酶點(diǎn)突變的GISA-2菌株的體外生長(zhǎng)繁殖能力無(wú)明顯降低[27]。Ramadhan等[29]在研究中比較了對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥和敏感的腸球菌的體外最大生長(zhǎng)速率,未顯示前者適應(yīng)性降低。

諸多實(shí)驗(yàn)表明,這是由于耐藥菌株進(jìn)一步發(fā)生補(bǔ)償突變,使得其適應(yīng)性恢復(fù)(表2)。如Bj?rkman等[8]發(fā)現(xiàn)由于rpsL、rpoB和gyrA基因突變所致鏈霉素、利福平和萘啶酸耐藥的鼠傷寒沙門菌的多數(shù)(6株/7株)對(duì)小鼠無(wú)毒力,但這些耐藥菌株很快通過(guò)不同形式的補(bǔ)償突變?cè)诰S持耐藥性的同時(shí)恢復(fù)菌株毒力。經(jīng)過(guò)序列分析rpsL基因突變耐藥株存在rpsL基因內(nèi)補(bǔ)償突變(42位點(diǎn)和93位點(diǎn)的ACA序列、AAC序列和CGT序列發(fā)生突變),一些突變株的毒力甚至超過(guò)了敏感株,提示可能存在rpsL基因外補(bǔ)償突變機(jī)制。而gyrA和rpoB基因突變耐藥株則通過(guò)基因內(nèi)補(bǔ)償突變恢復(fù)了菌株毒力。而由于katG基因突變而對(duì)異煙肼產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核分枝桿菌也通過(guò)基因外補(bǔ)償突變(高表達(dá)ahpC基因),在維持耐藥性的同時(shí)也恢復(fù)了毒力[34]。

同樣的對(duì)于攜帶耐藥質(zhì)粒而使得細(xì)菌適應(yīng)性降低的情況,也有報(bào)道補(bǔ)償突變的發(fā)生。McDermott等[35]的研究證實(shí)攜帶含有 TcR(四環(huán)素耐藥)基因的質(zhì)粒pBR322的大腸埃希菌一開(kāi)始最大生長(zhǎng)速率降低,經(jīng)連續(xù)傳代后獲得了適應(yīng)性補(bǔ)償,由于耐藥質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和數(shù)目并無(wú)明顯變化,提示可能細(xì)菌染色體發(fā)生了補(bǔ)償突變。Bouma等[36]的研究也顯示雖然一開(kāi)始攜帶pACYC184非結(jié)合質(zhì)粒的大腸埃希菌的體外適應(yīng)性是降低的,但當(dāng)在抗菌藥選擇壓力下傳代500代時(shí),細(xì)菌染色體出現(xiàn)了適應(yīng)補(bǔ)償(而非質(zhì)粒本身改變),從而使得細(xì)菌的適應(yīng)性升高。其他研究結(jié)果也提示抗生素選擇壓力存在的情況下,大多數(shù)細(xì)菌通過(guò)染色體適應(yīng)性突變從而克服攜帶質(zhì)粒的適應(yīng)性缺陷[30]。

細(xì)菌適應(yīng)性代價(jià)及其補(bǔ)償在不同條件下有其不同的意義。如已知肺炎鏈球菌野生株可以通過(guò)PgdA和Adr 2種酶修飾肽聚糖的不同部位,PgdA對(duì)N-乙酰葡萄糖胺脫乙?；?Adr乙?；疦-乙酰胞壁酸酯,從而造成對(duì)溶菌酶的耐受。Davis等[37]在研究中在溶菌酶 M(LysM+/+)和溶菌酶缺陷(LysM-/-)的小鼠模型中,同時(shí)接種肺炎鏈球菌野生株和pgdAadr突變株,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LysM+/+小鼠中野生株占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),在LysM-/-小鼠中突變株占優(yōu)勢(shì),提示肽聚糖的修飾本身在降低了菌株在無(wú)溶菌酶存在條件下的競(jìng)爭(zhēng)能力,但對(duì)溶菌酶的耐受性補(bǔ)償了其在寄殖中適應(yīng)性代價(jià)(通常存在溶菌酶)。

目前大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為適應(yīng)性代價(jià)意味著耐藥株在無(wú)抗生素環(huán)境中適應(yīng)性降低,生長(zhǎng)速率較敏感株減慢,然而自然環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)使得耐藥菌株需要通過(guò)基因進(jìn)化來(lái)克服這個(gè)缺陷重新獲得競(jìng)爭(zhēng)力[30]。很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明盡管有時(shí)在缺乏抗生素的條件下適應(yīng)性降低的無(wú)毒力耐藥株會(huì)回復(fù)突變成敏感株,但絕大多數(shù)都出現(xiàn)了通過(guò)補(bǔ)償突變(compensatory mutation)即第2位點(diǎn)突變(second site mutation),在不喪失耐藥性的同時(shí)來(lái)修復(fù)適應(yīng)性和毒力。這也表明減少抗生素的使用可能并不能使已經(jīng)出現(xiàn)在人體和環(huán)境中的耐藥細(xì)菌消失,第2靶位的補(bǔ)償突變能增加耐藥株的適應(yīng)性,使這些菌株在沒(méi)有抗生素的環(huán)境中和敏感株成功競(jìng)爭(zhēng)[30]。事實(shí)上臨床耐藥株可能已經(jīng)適應(yīng)了環(huán)境,補(bǔ)償了耐藥相關(guān)的適應(yīng)性代價(jià),從而引起耐藥細(xì)菌的廣泛傳播。

表2 染色體突變引起的適應(yīng)性降低的改善和補(bǔ)償Table 2.Compensatory evolution and amelioration of fitness losses caused by chromosomal mutations

對(duì)細(xì)菌耐藥性與適應(yīng)性關(guān)系的研究,是對(duì)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)和耐藥機(jī)制研究的重要補(bǔ)充,有助于我們更好理解細(xì)菌耐藥性的發(fā)生機(jī)制和傳播規(guī)律,進(jìn)而探索阻遏細(xì)菌耐藥性上升趨勢(shì)的更合理策略。

[1] Nuermberger EL,Bishai WR.Antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae：what does the future hold?[J].Clin Infect Dis,2004,38(Suppl 4)：S363-371.

[2] Bj? rkman J,Nagaev I,Berg OG,et al.Effects of environment on compensatory mutations to ameliorate costs of antibiotic resistance[J].Science,2000,287(5457)：1479-1482.

[3] Laurent F,Lelièvre H,Cornu M,et al.Fitness and competitive growth advantage of new gentamicin-susceptible MRSA clones spreading in French hospitals[J].J Antimicrob Chemother,2001,47(3)：277-283.

[4] Andersson DI,Levin BR.The biological cost of antibiotic resistance[J].Curr Opin Microbiol,1999,2(5)：489-493.

[5] Ho PL,Que T L,T sang DN,et al.Emergence of fluoroquinolone resistance among multiply resistant strains of Streptococcus pneumoniae in Hong Kong[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(5)：1310-1313.

[6] Azoulay-Dupuis E,Vallee E,Veber B,et al.In vivo efficacy of a new fluoroquinolone,sparfloxacin,against penicillin-susceptible and-resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia[J].Antimicrob Agents Chemother,1992,36(12)：2698-2703.

[7] Azoulay-Dupuis E,Rieux V,Muffat-Joly M,et al.Relationship between capsular type,penicillin susceptibility,and virulence of human Streptococcus pneumoniae isolates in mice[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(6)：1575-1577.

[8] Bj? rkman J,Hughes D,Andersson DI.Virulence of antibiotic-resistant Salmonellaty phimurium[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(7)：3949-3953.

[9] Maisnier-Patin S,Berq OG,Liljas L,et al.Compensatory adaptation to the deleterious effect of antibiotic resistance in Salmonella ty phimurium[J].Mol Microbiol,2002,46(2)：355-366.

[10] Bj? rkman J,Samuelsson P,Andersson DI,et al.Novel ribosomal mutations affecting translational accuracy,antibiotic resistance and virulence of Salmonella ty phimurium[J].Mol Microbiol,1999,31(1)：53-58.

[11] Giraud E,Cloeckaert A,Baucheron S,et al.Fitness cost of fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].J Med Microbiol,2003,52(pt 8)：697-703.

[12] Johansson U,Evarsson A,Liljas A,et al.The dynamic structure of EF-G studied by fusidic acid resistance and internal revertants[J].J Mol Biol,1996,258(3)：420-432.

[13] Paulander W,Maisnier-Patin S,Andersson DI.Multiple mechanisms to ameliorate the fitness burden of mupirocin resistance in Salmonella typhimurium[J].Mol Microbiol,2007,64(4)：1038-1048.

[14] Schrag SJ,Perrot V.Reducing antibiotic resistance[J].Nature,1996,381(6578)：120-121.

[15] Billington OJ,McHugh TD,Gillespie SH.Physiological cost of rifampin resistance induced in vitro in Mycobacterium tuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(8)：1866-1869.

[16] Wilson T M,de Lisle GW,Collins DM.Effect of inhA and katG on isoniazid resistance and virulence of Mycobacterium bovis[J].M ol Microbiol,1995,15(6)：1009-1015.

[17] Li Z,Kelley C,Collins F,et al.Expression of katG in Mycobacterium tuberculosis is associated with it growth and persistence in mice and guinea pigs[J].J Infect Dis,1998,177(4)：1030-1035.

[18] Trzcinski K,Thompson CM,Gilbev AM,et al.Incremental increase in fitness cost with increased beta-lactam resistance in pneumococci evaluated by competition in an infant rat nasal colonization model[J].J Infect Dis,2006,193(9)：1296-1303.

[19] Rieux V,Carbon C,Azoulay-Dupuis E.Complex relationship between acquisition of beta-lactam resistance and loss of virulence in Streptococcus pneumoniae[J].J Infect Dis,2001,184(1)：66-72.

[20] Johnson CN,Briles DE,Benjamin WH Jr,et al.Relative fitness of fluoroquinolone-resistant Streptococcus pneumoniae[J].Emerg Infect Dis,2005,11(6)：814-820.

[21] Balsalobre L,de la Campa AG.Fitness of Streptococcus pneumoniae fluoroquinolone-resistantstrains with topoisomerase IV recombinant genes[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(3)：822-830.

[22] Rozen DE,M cGee L,Levin BR,et al.Fitness costs of fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(2)：412-416.

[23] Wolter N,Smith AM,Farrell DJ,et al.Heterogeneous macrolide resistance and gene conversion in the pneumococcus[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(1)：359-361.

[24] Kanai K,Shibayama K,Suzuki S,et al.Growth competition of macrolide-resistant and-susceptible Helicobacter pylori strains strains[J].Microbiol Immunol,2004,48(12)：977-980.

[25] Kugelberg E,Lofmark S,Wretlind B,et al.Reduction of the fitness burden of quinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa[J].J Antimicrob Chemother,2005,55(1)：22-30.

[26] Sánchez P,Linares JF,Ruiz-D í ez B,et al.Fitness of invitro selected Pseudomonas aeruginosa nalB and nfxB multidrug resistant mutants[J].J Antimicrob Chemother,2002,50(5)：657-664.

[27] Hurdle JG,O'Neill AJ,Chopra I.The isoleucyl-tRNA sy nthetase mutation V588F conferring mupirocin resistance in gly copeptide-intermediate Staphylococcus aureus is not associated with a significant fitness burden[J].J Antimicrob Che-mother,2004,53(1)：102-104.

[28] Bj? rkman J,Andersson DI.The cost of antibiotic resistance from a bacterial perspective[J].Drug Resist Updat,2000,3(4)：237-245.

[29] Ramadhan AA,Hegedus E.Survivability of vancomycin resistant enterococci and fitness cost of vancomycin resistance acquisition[J].J Clin Pathol,2005,58(7)：744-746.

[30] Gillespie SH,M cHugh TD.T he biological cost of antimicrobial resistance[J].T rends Microbiol,1997,5(9)：337-339.

[31] Lee SW,Edlin G.Expression of tetracycline resistance in pBR322 derivatives reduces the reproductive fitness of plasmidcontaining Escherichia coli[J].Gene,1985,39(2-3)：173-180.

[32] Lenski RE,Simpson SC,Nguyen T T.Genetic analysis of a plasmid-encoded,host genotype-specific enhancement of bacterial fitness[J].J Bacteriol,1994,176(11)：3140-3147.

[33] Enne VI,Delsol AA,Roe JM,et al.Rifampicin resistance and its fitness cost in Enterococcus faecium[J].J Antimicrob Chemother,2004,53(2)：203-207.

[34] Sherman DR,Mdluli K,Hickey MJ,et al.Compensatory ahpC gene expression in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis[J].Science,1996,272(5268)：1641-1643.

[35] McDermott PJ,Gowland P,Gowland PC.Adaptation of Escherichia coli growth rates to the presence of pBR322[J].Lett Appl Microbiol,1993,17(3)：139-143.

[36] Bouma JE,Lenski RE.Evolution of a bacteria/plasmid association[J].Nature,1988,335(6188)：351-352.

[37] Davis KM,Akinbi HT,Standish AJ,et al.Resistance to mucosal lysozyme compensates for the fitness deficit of peptidoglycan modifications by Streptococcus pneumoniae[J].PloS Pathog,2008,4(12)：e1000241.