郭道華,韋穎梅,王小靜,葉 云

缺血性心肌病是危害人類健康的最常見疾病之一,隨著急診溶栓和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等再灌注治療的開展,心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的治療成為臨床上療效不佳的一個(gè)重要原因,再灌注時(shí)產(chǎn)生的氧自由基和細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能是心肌缺血再灌注損傷重要的發(fā)病環(huán)節(jié),有研究證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了缺血再灌注性損傷[1],葡萄糖調(diào)控蛋白(glucose-regulated protein78,GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的伴侶分子,具有減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)、保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)是從傳統(tǒng)中藥白芍中提取的有效成分,主要含有芍藥苷、芍藥新苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等成分?，F(xiàn)代藥理證明,TGP具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、耐缺氧、抗氧化和抗心肌缺血等作用[2-4],臨床上常用于免疫、風(fēng)濕疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)通過觀察白芍總苷作用下心肌缺血再灌注損傷大鼠心功能及GRP78表達(dá)的變化,來探討白芍總苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對GRP78的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 48只成年 SD大鼠,雌性,體重250 g～280 g,由蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;白芍總苷粉劑和羧甲基纖維素鈉由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所惠贈(zèng);葛根素(三東瑞陽制藥有限公司,批號:03020001);Powerlab/16sp數(shù)據(jù)采集和分析多導(dǎo)系統(tǒng):AD Instruments Australia產(chǎn)品;DH-140B動(dòng)物人工呼吸機(jī):浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠產(chǎn)品,GRP78多克隆抗體:(Santacruz)公司

1.2 心肌缺血再灌注損傷的模型建立 取SD大鼠稱重,術(shù)前12 h禁食,腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)麻醉,針狀電極插入左前肢、右前肢、左后肢皮下,連續(xù)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸正中切開,于3～4氣管軟骨環(huán)間切開并行插管接動(dòng)物呼吸機(jī)正壓控制呼吸,結(jié)扎右頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。監(jiān)測心功能參數(shù)。以心電圖顯示ST段抬高、QRS波變高變寬和心肌變?yōu)榍嘧仙珵榻Y(jié)扎成功的標(biāo)志。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為6組,每組8只。假手術(shù)組(sham組):LAD穿線但不結(jié)扎,曠置 90 min,術(shù)前1周用0.5%的羧甲基纖維素鈉灌胃。模型組(I/R):缺血30 min再灌注90 min,術(shù)前1周用0.5%的羧甲基纖維素鈉灌胃。TGP組:50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg TGP 分別灌胃 一周;葛根素(PUE組):100 mg/kg PUE于再灌注前5 min經(jīng)右頸總推注。

1.4 觀察指標(biāo) 觀測缺血前、缺血30 min、再灌90 min時(shí)心率(HR)、左心室收縮峰壓(LVSP)、左心室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 Western blot法 根據(jù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶攸c(diǎn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的要求采用每組4個(gè)標(biāo)本,具體方法:勻漿大鼠M/I處心肌組 織 ,提取 蛋白 ,用BCA法蛋白 定量 ,取 20 μ L樣 品,SDS-PAGE電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Millipore-Corporation),50 g/L脫脂奶粉封閉后依次加入一抗(GRP78抗體體積比1∶300)、二抗(堿磷酶標(biāo)記的山羊抗兔體積比1∶6 000)

2 結(jié) 果

2.1 TGP和PUE對大鼠心肌缺血再灌注損傷血流動(dòng)力學(xué)的影響 模型組在缺血30min后以及再灌注90min后,LVSP和±dp/dtmax均明顯下降,LVEDP明顯上升(P＜0.05),說明心臟的舒縮功能明顯受損。與I/R組相比,不同劑量的TGP組與葛根素組相對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的 LVSP和 ±dp/dtmax均能不同程度的提高、LVEDP不同程度的降低(P＜0.05),提示TGP可使缺血再灌注損傷所致的心臟舒縮功能障礙明顯減輕。詳見表1～表4。

表1 白芍總苷對I/R大鼠心率的影響(±s)/min

表1 白芍總苷對I/R大鼠心率的影響(±s)/min

組別 劑量 n 結(jié)扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham 組 - 10 320.00±21.23 310.80±16.48 300.65±11.15 I/R組 - 10 310.78±18.59 299.67±12.651) 273.76±18.281)TGP組 50 mg/kg 10 329.49±22.50 314.42±19.87 302.88±22.43 100 mg/kg 10 319.03±21.54 303.43±15.18 292.83±17.93 200 mg/kg 10 310.33±16.04 293.08±20.88 281.61±22.83 PUE組 100 mg/kg 10 323.33±19.02 300.16±12.69 300.93±16.79與Sham組比較,1)P＜0.05

表2 白芍總苷對I/R大鼠+dp/dtmax的影響(±s)mmHg/s×10-3

表2 白芍總苷對I/R大鼠+dp/dtmax的影響(±s)mmHg/s×10-3

組別 劑量mg/kg n 結(jié)扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham組 - 8 4.11±0.23 4.02±0.25 3.95±0.15 I/R組 - 8 4.08±0.29 3.15±0.271) 3.37±0.181)TGP組 50 mg/kg 8 3.98±0.50 3.32±0.172) 3.43±0.212)100 mg/kg 8 4.03±0.54 3.49±0.182) 3.63±0.132)200 mg/kg 8 4.07±0.24 3.67±0.212) 3.81±0.292)PUE組 100 mg/kg 8 4.10±0.13 3.66±3.692) 3.83±0.262)與Sham組比較,1)P＜0.05;與I/R組比較,2)P＜0.05

表3 白芍總苷對I/R大鼠-dp/dtm ax的影響(±s)mmHg/s×10-3

表3 白芍總苷對I/R大鼠-dp/dtm ax的影響(±s)mmHg/s×10-3

組別 劑量 n 結(jié)扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham組 - 8 3.16±0.23 3.05±0.15 2.96±0.15 I/R組 - 8 3.13±0.26 1.97±0.371) 2.08±0.331)TGP組 50 mg/kg 8 3.08±0.34 2.27±0.242) 2.44±0.172)100 mg/kg 8 3.06±0.23 2.41±0.202) 2.65±0.182)200 mg/kg 8 3.11±0.54 2.74±0.432) 2.89±0.492)PUE組 100 mg/kg 8 3.04±0.33 2.67±0.352) 2.93±0.382)與Sham組比較,1)P＜0.05;與I/R組比較,2)P＜0.05

表4 白芍總苷對I/R大鼠LVSP的影響(±s)mmHg

表4 白芍總苷對I/R大鼠LVSP的影響(±s)mmHg

組別 劑量 n 結(jié)扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham組 - 8 127.4±4.2 126.8±3.8 123.6±6.5 I/R組 - 8 128.7±4.7 91.5±2.21) 97.1±2.71)TGP組 50 mg/kg 8 127.8±3.8 99.4±2.62) 108.8±2.52)100 mg/kg 8 132.3±4.1 104.4±3.12) 110.3±3.42)200 mg/kg 8 127.9±3.0 115.4±2.62) 121.1±3.72)PUE組 100 mg/kg 8 131.3±4.2 118.1±3.12) 125.9±2.72)與Sham組比較,1)P＜0.05;與I/R組比較,2)P＜0.05

2.2 白芍總苷對I/R大鼠GRP78表達(dá)的影響(見圖1)

圖1 白芍總苷對I/R大鼠G RP78表達(dá)的影響

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷作為一種應(yīng)激源可引發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5],GRP78位于心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,可參與這一過程。具體情況是當(dāng)組織器官在缺血、缺氧、低糖、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣平衡紊亂等情況下,可導(dǎo)致GRP78大量表達(dá)[6],同時(shí)它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白結(jié)合恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象,修改其構(gòu)型,維持新生肽的折疊、移位、組裝、分泌,保持細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下蛋白質(zhì)繼續(xù)合成,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,因此,GRP78在應(yīng)激條件下對細(xì)胞起保護(hù)作用[7]。

本研究中血流動(dòng)力學(xué)的觀察表明,3種劑量組的白芍總苷可以明顯改善心功能并可減輕缺血再灌注損傷對心功能產(chǎn)生的影響。缺血再灌注初期GRP78的上調(diào)提示缺血再灌注導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)啟動(dòng)后,GRP78發(fā)揮分子伴侶蛋白的作用,通過修復(fù)錯(cuò)誤折疊蛋白以及未折疊蛋白,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷使細(xì)胞得以存活,再灌注90 min不同用藥組GRP78表達(dá)的情況不一致,其中小劑量、中劑量和高劑量的白芍總苷治療組中GRP78的表達(dá)明顯高于模型組的表達(dá),這說明白芍總苷對在體缺血再灌注大鼠心肌GRP78蛋白的表達(dá)有一定的影響,這一影響可能通過上調(diào)GRP78的表達(dá),來對抗缺血應(yīng)激損傷而發(fā)揮其保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)表明,白芍總苷可能通過促進(jìn)缺血再灌注損傷組織GRP78的表達(dá),發(fā)揮早期內(nèi)源性的保護(hù)作用,但其詳細(xì)機(jī)制并不十分清楚,可能與白芍總苷有擴(kuò)張血管,降低血流阻力,改善心肌組織細(xì)胞的缺氧狀態(tài),促進(jìn)ATP的合成有關(guān),因GRP78的合成需要消耗大量的ATP,而當(dāng)ATP的量增加時(shí),GRP78的表達(dá)量發(fā)生上調(diào),這樣就會(huì)進(jìn)一步發(fā)揮其保護(hù)作用,減輕缺血再灌注損傷。但其如何有效調(diào)節(jié)并在心血管疾病中得到廣泛運(yùn)用有待進(jìn)一步的研究。

[1]Kaminski KA,Bonda TA,Korecki J,et al.Oxidative stress and neutrophil activation the two keystones of ischemia/reperfusion injury[J].Int J Cardiol,2002,86:41-59.

[2]Wang YX,Chen MZ,Xu SY.Analgesic effect of total glucosides of paeonia lactifloran[J].Chin J Phamacol Toxicol,1988,2(1):6-8.

[3]Li J,Liang JS,Zhou AW,et al.Modulatory effects of total glucosides of paeony on bly mphocyte proliferation and interleukin 1 production[J].Chin J Phamacol T oxicol,1994,8(1):6-8.

[4]Zhang JS,Wang Y,Wang YX,et al.Experimental studies on the resistance to hy poxia of total g lucosides of paeony root[J].Chin Phamacol Bull,1989,5(3):172-176.

[5]Zhu XG,Wei YM,Liu GL,et al.Protective effects of ntotal glucosides of paeony root on acute myocardial ischemia in rats and rabbits[J].Chin Phamacol Bull,1999,15(3):252-254.

[6]Reddy RK,Mao C,Baumeisterp,et al.Endoplasmic reticulum chaperone protein GRP78 protects cells from apoptosis induced by topoisimerase inhibitors role of ATP binding site in suppression of caspase-7 activation[J].J Biol Chem,2003,278:20915-20924.

[7]Schneeloch E,Wenkel S,Mies G,et al.Spreading depression activates un-folded protein response[J].Neurosci Lett,2004,368:37-40.