胡 瓊,劉瑞珍

腦缺血再灌注是大多數(shù)缺血性腦血管病的主要生理病理過(guò)程,其中細(xì)胞凋亡是主要環(huán)節(jié)[1]。caspase-8是介導(dǎo)死亡受體通路和線粒體通路兩條凋亡途徑的關(guān)鍵性酶,活化的 caspase-8能激活兩條凋亡通路下游的caspase,擴(kuò)大凋亡信號(hào),從而引發(fā)致死性的蛋白分解級(jí)聯(lián)反應(yīng)[2]。丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP)能夠有效的抑制急性腦缺血性損傷的多個(gè)病理環(huán)節(jié),在腦缺血再灌注損傷凋亡中起關(guān)鍵作用[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷中caspase-8蛋白表達(dá)的研究,探討其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性 Wistar大鼠180只,體重200 g～250 g,由山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 丁苯酞石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供,批號(hào):08100111。caspase-8單克隆抗體購(gòu)自 Santa Cruz公司,二抗及Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)由山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供。

1.3 方法

1.3.1 局灶性腦缺血再灌注模型建立 缺血再灌注模型采用改良的Zea Longa大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型制備[4,5]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(n=36);缺血1 h再灌注組(n=36);NBP治療組(n=36):缺血再灌注1 h后給予腹腔注射NBP 80 mg/kg[6];NBP預(yù)防組(n=36):給予NBP 80 mg/kg灌胃,每日1次,1周后行腦缺血再灌注模型的制備;NBP預(yù)防治療組(n=36):給予NBP 80 mg/kg每日1次灌胃,1周后行缺血再灌注術(shù)后1 h給予腹腔注射NBP80 mg/kg。假手術(shù)組和缺血1 h再灌注組術(shù)后1 h給予等劑量的0.5%Tween80溶劑。每組又按處死時(shí)間點(diǎn)分為 6 h、12 h、24 h 3個(gè)亞組,每個(gè)亞組12只。

1.3.3 神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分 缺血1 h再灌注6 h、12 h、24 h后觀察大鼠神經(jīng)功能缺失狀態(tài),用單盲法進(jìn)行Zas-Longa的5分制法評(píng)分[4]。采用大鼠手術(shù)麻醉清醒后神經(jīng)功能缺損1分～3分且無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。0分、4分或死亡剔除,再隨機(jī)補(bǔ)充。

1.3.4 標(biāo)本留取 Western blot檢測(cè)的標(biāo)本留取,各組動(dòng)物分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將大鼠麻醉后直接斷頭取腦,去除正常的一側(cè)大腦及小腦,放于-70℃冰箱中保存。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色 將組織石蠟塊切片,脫蠟、抗原修復(fù)、滴加 1∶200的 caspsae-8抗體,加二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。每張片子在400倍顯微鏡下,隨機(jī)取左側(cè)大腦半球缺血區(qū)10個(gè)視野,計(jì)算其陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值。

1.3.6 Western blot測(cè)定 將收集的組織標(biāo)本取100 mg放入1.5 mL離心管內(nèi),加蛋白裂解液1 mL(RIPA裂解緩沖液),置溫浴中超聲勻漿,10 000 r/min,離心5 min后取上清加入等體積的2×SDS buffer,煮沸5 min,迅速冰浴,10 000 r/min,離心5 min,取上清用于后面實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋白電泳分析。應(yīng)用QUAN TITYONE(Bio-Rad)軟件進(jìn)行光密度定量,所得結(jié)果以β-actin為參考。

1.3.7 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 凋亡程度以每個(gè)視野中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表示,每張切片隨機(jī)取6個(gè)～8個(gè)視野進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,任意兩組之間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺失體征表現(xiàn) 腦缺血再灌注24 h后在大鼠靜息狀態(tài)下神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)為左前肢屈曲,肌張力降低,側(cè)推阻力降低;活動(dòng)減少,自發(fā)向左側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈;可伴或不伴有右側(cè)Horner征。假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀,缺血再灌注組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀。與缺血再灌注組比較,NBP治療組及NBP預(yù)防治療組能明顯改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺失癥狀,NBP預(yù)防組對(duì)缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺失癥狀有所改善且大鼠腦缺血再灌注術(shù)后清醒快,清醒后精神狀態(tài)明顯比缺血再灌注組好。

2.2 病理形態(tài)觀察(HE染色)假手術(shù)組腦組織HE染色,皮質(zhì)和海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰嚴(yán)密,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。缺血再灌注組缺血側(cè)出現(xiàn)范圍較大的梗死灶,甚至在病理切片上幾乎占據(jù)整個(gè)大腦半球的梗死灶,梗死灶核心區(qū)域成篩狀改變,組織結(jié)構(gòu)消失;海馬組織結(jié)構(gòu)明顯異常,細(xì)胞排列紊亂、數(shù)目減少、皺縮變形。與缺血再灌注組比較,NBP治療組海馬組織細(xì)胞排列略呈紊亂,細(xì)胞皺縮變形、胞核固縮等表現(xiàn)明顯減輕。NBP預(yù)防組與缺血再灌注組病理形態(tài)學(xué)改變亦有差別,其凋亡程度較其輕。NBP預(yù)防治療組光鏡下與NBP治療后的病理形態(tài)學(xué)改變無(wú)明顯差異。

2.3 Caspase-8的表達(dá) 假手術(shù)組偶見散在caspase-8陽(yáng)性細(xì)胞。與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)大量caspase-8陽(yáng)性細(xì)胞,廣泛分布于皮質(zhì)和海馬組織梗死灶周邊區(qū)域(P＜0.05),主要在神經(jīng)元胞漿中表達(dá),部分核內(nèi)也可見。NBP治療組、預(yù)防組及預(yù)防治療組的caspase-8陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,與缺血再灌注組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。NBP預(yù)防治療組與NBP治療組比較,在缺血再灌注后6 h、12 h時(shí)caspase-8的表達(dá),治療組少于預(yù)防治療組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 大鼠腦皮層caspase-8表達(dá)的平均灰度值比較(±s)

表1 大鼠腦皮層caspase-8表達(dá)的平均灰度值比較(±s)

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術(shù)組 36 177.47±1.67 177.57±1.17 177.49±1.08缺血再灌注組 36 154.71±0.97 150.59±1.181) 146.66±1.102)NBP治療組 36 168.26±1.193) 170.41±1.112)3) 175.87±0.902)3)NBP預(yù)防組 36 157.61±0.923)4) 160.29±1.252)3)4) 165.36±1.222)3)4)NBP預(yù)防治療組 36 169.25±0.963)5) 172.50±0.842)3)4) 176.19±1.262)3)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與前一時(shí)間點(diǎn)比較,2)P＜0.01;與缺血再灌注組比較,3)P＜0.01;與治療組比較,4)P＜0.05

2.4 Western blot測(cè)定結(jié)果 正常大鼠及假手術(shù)組中腦組織caspase-8活性片段的蛋白表達(dá)量很低。缺血再灌注組caspase-8蛋白的表達(dá)量明顯上調(diào)(P＜0.05)。NBP治療組、預(yù)防組及預(yù)防治療組的蛋白表達(dá)明顯低于缺血再灌注組(P＜0.01),NBP預(yù)防組的Caspase-8蛋白表達(dá)與缺血再灌注組比較,表達(dá)量有所減少,但不如治療組下調(diào)明顯(P＜0.05);預(yù)防治療組在缺血再灌注24h表達(dá)與治療組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 Western印跡缺血再灌注24 h caspase-8表達(dá)(±s)

組別 caspase-8/beta正常組 0.668±0.026假手術(shù)組 0.670±0.015缺血再灌注組 1.101±0.0171)NBP治療組 0.730±0.0282)NBP預(yù)防組 0.816±0.0232)3)NBP預(yù)防治療組 0.736±0.0402)4)與任一組比較,1)P＜0.05;與缺血再灌注組比較,2)P＜0.01;與治療組比較,3)P＜0.05

3 討 論

人的腦組織對(duì)缺血以及再灌注均非常敏感,易發(fā)生缺血再灌注損傷。腦組織發(fā)生缺血性改變后,梗死灶中心以細(xì)胞死亡為主,而在梗死灶邊緣,細(xì)胞的丟失則以凋亡為主。因而,有效地減少細(xì)胞過(guò)度凋亡可以減輕缺血再灌注對(duì)組織器官的損傷。

caspase家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的蛋白酶。腦缺血后發(fā)生的神經(jīng)元凋亡其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜,目前認(rèn)為主要有兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,即死亡受體通路和線粒體通路,而這兩條通路都以caspase-8基因的激活為特征。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,大鼠腦缺血再灌注后,各組中caspase-8蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯升高,而且分布及動(dòng)態(tài)演變規(guī)律與缺血后神經(jīng)元凋亡的變化基本一致,提示此蛋白參與了腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生和發(fā)展。因此對(duì)caspase-8蛋白質(zhì)進(jìn)行早期干預(yù),有可能避免或降低凋亡的發(fā)生,從而減輕缺血性損傷。

NBP是人工合成的消旋體,其左旋體存在于芹菜籽中。現(xiàn)代藥理研究表明,NBP可增加缺血區(qū)腦血流。

本實(shí)驗(yàn)觀察到,caspase-8在缺血再灌注后隨時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)持續(xù)增高,隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),其主要表達(dá)在缺血周圍區(qū)域,提示caspase-8可能參與缺血后神經(jīng)元凋亡的病理生理過(guò)程。假手術(shù)組可偶見散在caspase-8陽(yáng)性細(xì)胞,可能與手術(shù)創(chuàng)傷刺激有關(guān)。丁苯酞治療組及預(yù)防治療組可明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)功能缺失癥狀和腦組織的病理?yè)p害,還可以顯著減少各時(shí)間點(diǎn)梗死灶周邊缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元caspase-8的表達(dá)。丁苯酞預(yù)防組與缺血再灌注組比較,同樣能下調(diào)caspase-8蛋白的表達(dá)量,但較治療組及預(yù)防治療組效果較差,提示 NBP提前預(yù)防給藥可以適當(dāng)減少caspase-8的表達(dá),從而有一定的預(yù)防缺血性腦血管病的作用。

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