黃大毛，孟菁菁，謝春蕾，吳尚輝，顧煥華，唐發(fā)清

（中南大學 1.湘雅醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410008；2.湘雅醫(yī)學院細胞中心，湖南 長沙 410078）

小檗堿（Berberine，BBR）是毛莨科植物黃連（Coptis chinensis Franch）根莖提取的主要的有效成分，分子式為[C20H18NO4]+，分子量為336.37。BBR不僅具有廣譜的抗菌消炎的藥理作用，而且具有廣泛的抗腫瘤效應。研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌的防治中，BBR具有重要作用。BBR或含BBR的藥物能夠降低鼻咽癌高危人群EBV相關抗體滴度或使其轉為陰性[1，2]，抑制 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）潛伏感染，降低鼻咽癌的發(fā)病率[3]。為進一步明確BBR抑制EB病毒潛伏感染療效和闡明BBR作用的機制，本文以帶EB病毒的Raji細胞為細胞模型，研究小檗堿對EB病毒復制的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 Raji細胞（ATCC CCL86）購自中南大學分析測試中心細胞生物研究室。Raji細胞是攜帶和自主復制EBV基因的人Burkitt's淋巴瘤細胞，懸浮生長，聚集成團，體積較大，折光性較強。

1.1.2 主要儀器和試劑 Mx3000p型熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司。鹽酸小檗堿（Berberine Chloride），C20H18ClNO4購自 Sigma公司（633-65-8），MTT試劑購自 Sigma公司（57360-69-7）。Hyclone改良型RPMI1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司。病毒DNA小劑量抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術有限公司。Taq DNA聚合酶、dNTPs購自廣州達安基因股份有限公司。其它儀器試劑均由中南大學現(xiàn)代分析測試中心細胞生物研究室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Raji細胞株接種到含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，待細胞處于對數(shù)生長期進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制試驗 取對數(shù)生長期Raji細胞，用含藥培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為104個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液），每組設置4個平行孔，于37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入20μL MTT溶液，輕輕搖勻，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。1000 r/min離心10 min，棄去上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶標儀在490 nm波長下測量各孔的吸光度值。

1.2.3 巢式熒光定量PCR檢測EBV-DNA ①標準品的制備：取Raji細胞凍存液進行細胞計數(shù)，根據(jù)文獻[4]報道的每個Raji細胞約含有50個拷貝的EBV-DNA進行計算，得到Raji細胞凍存液中E BV-DNA的濃度為2.9×105拷貝/μL。②巢式熒光定量PCR檢測EBV-DNA：使用病毒DNA小量抽提試劑盒從培養(yǎng)的Raji細胞中抽提病毒DNA，操作步驟按試劑盒說明書（稍加改進）進行。選擇EB病毒DNA全序列20206～20426位為外擴增區(qū)，20279～20343位為內(nèi)擴增區(qū)，熒光探針在內(nèi)擴增區(qū)內(nèi)20299～20318位。外擴增引物：上游引物為5'-TC AAAACTTTAGAGGCGAATGG-3'，下游引物為5'-CTGAGAAGGTGGCCTAGCAAC-3'，擴增片段長度為221 bp。內(nèi)擴增引物：上游引物為5'-CCA GGAAGCGGGTCTATGG-3'，下游引物序列為5'-GGCTTATTCCTCTTTTCCCCT CTA-3'，擴增片段長度為 65 bp。熒光探針：Taqman探針序列5'-FAM-TGGCTGCGCTGCTGCTATC-TAMRA-3'。擴增引物、探針由廣州達安基因股份有限公司設計合成。標準品的外擴增反應體系及反應條件：將Raji細胞抽提的EBV-DNA稀釋成一定濃度梯度（1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷貝 /50μL反應體系）。50μl反應體系：5×定性緩沖液10μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 1μL，上游外引物1μL，下游外引物1μL，標準品nμL（n為根據(jù)濃度計算的體積0.40），加水補至50μL。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 個循環(huán)；72℃ 7 min。樣品的外擴增反應體系及反應條件：50μL反應體系：5×定性緩沖液 10μL，Taq DNA聚合酶 1μL，dNTPs 1μL，上游外引物 1μL，下游外引物1μL，模板10μL，加水補至50μL。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃ 7 min。內(nèi)擴增反應體系及反應條件：標準品與樣品相同。50μl反應體系：5×定量緩沖液 10μL，Taq DNA聚合酶 1μL，dNTPs 1μL，上游內(nèi)引物1μL，下游內(nèi)引物1μL，Taqman探針1μL，外擴增產(chǎn)物5μL，加水補至50μL。反應條件：95℃5 min；95℃ 45s，55℃ 45 s，40 個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)值用均數(shù)±標準差（）表示，兩個均數(shù)比較采用t檢驗以及獨立樣本T檢驗。

2 結果

2.1 MTT法檢測BBR對Raji細胞的細胞無毒性濃度

為觀察BBR對鼻咽癌細胞生長的影響，采用MTT法分析不同濃度（100、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0μmol/L）BBR 處 理Raji細胞后細胞增殖情況。結果顯示，在BBR濃度分別為 10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 μmol/L時，細胞數(shù)與空白組比較無明顯差異（P＞0.05），而 BBR 濃度為 100、80、40、20μmol/L時，細胞數(shù)明顯少于對照組（P＜0.05），且細胞數(shù)隨BBR濃度的增高而減少（圖2），表明高濃度（10μmol/L以上）BBR對Raji細胞增殖生長有明顯的抑制作用。鑒于在10μmol/L以下濃度的BBR對Raji細胞生長增殖沒有明顯影響，因而BBR對Raji細胞的細胞無毒性濃度為0～10μmol/L。

圖1 BBR分子結構

圖2 BBR對Raji細胞的抑制作用

2.2 不同濃度BBR對Raji細胞形態(tài)的影響

為進一步確證細胞無毒性濃度的BBR對Raji細胞生長的影響，用倒置顯微鏡觀察不同濃度（40、10、1.25μmol/L）BBR處理的Raji細胞形態(tài)。結果表明，用細胞無毒性濃度的BBR（10、1.25μmol/L）處理的Raji細胞，與對照組細胞一樣呈懸浮生長，生長良好，細胞呈圓形、體積較大、折光性強。當BBR濃度為40μmol/L時，細胞數(shù)明顯少于對照組，細胞散在生長且未聚集成團，體積略小，折光性較低（圖3）。

圖3 不同濃度BBR處理后的Raji細胞形態(tài)

2.3 巢式熒光定量PCR檢測EBV-DNA表達

2.3.1 建立標準曲線 用稀釋成不同濃度的Raji細胞進行擴增反應，反應結束時得出擴增的動力學曲線（圖4）及熒光定量標準曲線（圖5）。

圖4 標準品擴增曲線

圖5 標準曲線

圖6 不同濃度BBR處理Raji細胞后EBV-DNA拷貝數(shù)的變化

2.3.2 不同濃度BBR處理的Raji細胞中EBV-DNA表達 運用巢式熒光定量PCR方法分別檢測不同濃度 BBR（40、10、1.25 和 0μmol/L）處理的Raji細胞中EBV-DNA表達，根據(jù)已建立的標準曲線計算不同藥物濃度處理的Raji細胞中EBV-DNA的拷貝數(shù)。結果顯示，細胞無毒性濃度的BBR（10、1.25μmol/L）處理 Raji細胞后，EBV-DNA的拷貝數(shù)明顯低于未經(jīng)藥物處理組（P＜0.05），見圖6。

3 討論

鼻咽癌是我國南方一種常見的頭頸部惡性腫瘤，鼻咽癌確切發(fā)病機制尚不十分明確，目前無法進行鼻咽癌的一級預防。研究表明，EBV的感染與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5，6]，EB病毒不僅參與了鼻咽癌各階段，而且EB病毒潛伏感染的程度，如EB病毒相關抗體滴度和DNA拷貝數(shù)，間接提示鼻咽癌疾病狀態(tài)，尤其是鼻咽癌高危人群的預防方面，已經(jīng)將降低和清楚EB病毒潛伏感染作為鼻咽癌高危人群預防一項重要指標[7，8]。

BBR是一種異喹啉生物堿，為白毛茛、黃柏、黃連等植物藥的主要成分，具有抗菌、抗感染、解熱鎮(zhèn)痛等作用[9]。近年來，BBR又被證實具有抗腫瘤作用[10，11]。BBR 抗腫瘤機制研究表明，BBR通過抑制COX-2[12]、DNA拓撲異構酶[13]以及與DNA形成復合物[14，15]等方式，抑制腫瘤細胞的 DNA、RNA和蛋白質合成；通過抑制激活蛋白-1（AP-1）的活性，阻斷腫瘤轉移相關的信號通路等，最終抑制腫瘤轉移[16]。在我們的前期研究工作中，用BBR或含BBR的中藥復方進行鼻咽癌高危人群預防[1]，發(fā)現(xiàn)其能降低鼻咽癌高危人群EBV相關抗體滴度或使其轉為陰性[2]，進而抑制EBV潛伏感染，降低鼻咽癌的發(fā)病率[3]。在增強鼻咽癌患者放射治療的敏感方面，BBR的中藥復方降低鼻咽癌患者EBV相關抗體，增強鼻咽癌放療的敏感性[17]。由此，我們推測在BBR可能干預EBV病毒復制，進而降低鼻咽癌組織或者血漿中EBV-DNA的含量。

本文采用巢式-熒光定量PCR方法檢測BBR處理Raji細胞后EBV-DNA拷貝數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，BBR能夠明顯抑制Raji細胞中EBV-DNA復制，且呈藥物濃度依賴性。此結果提示，BBR也可能通過抑制鼻咽癌細胞EBV-DNA的復制降低鼻咽癌的發(fā)生。在本項目研究中，為排除因藥物毒性作用而對細胞生長產(chǎn)生影響，我們采用MTT法篩選BBR的無細胞毒性濃度，該濃度對細胞生長增殖沒有明顯毒性，因而我們認為BBR對Raji細胞EBV-DNA復制抑制作用不是因為其本身毒性作用影響細胞生長，而是小檗堿的藥理學作用，其具體作用分子機制有待進一步研究。

BBR抑制EBV-DNA的復制，因而可以阻斷EBV致癌作用，降低鼻咽癌的發(fā)生率。另外，BBR在治療過程中毒性較小以及價格低廉，因而，在鼻咽癌的一級預防應用中有潛在臨床應用前景。

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