李輝 張開基 李萬成

糖原合成酶激酶－3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)不但參與肌肉能量儲存和新陳代謝，還參與多種生物學效應，如在胚胎發(fā)育、細胞分化、細胞周期調節(jié)、腫瘤形成等多方面發(fā)揮重要作用。GSK-3是WNT信號途徑和NF-κB信號系統發(fā)生交叉對話(crosstalk)的結合點，研究證實WNT信號途徑的異常持續(xù)激活參與了包括惡性腫瘤在內多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如大腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌以及肝癌等。在WNT信號通路中GSK-3起著關鍵負性調節(jié)酶作用，它通過促進癌蛋白β-連接素(β-catenin)降解而抑制該信號通路的激活。

但有研究報道，使用GSK-3高選擇性抑制劑——鋰劑能夠誘發(fā)多種腫瘤細胞的凋亡，如人髓性細胞白血病細胞系HL-60、人單核細胞白血病細胞系U937和人卵巢癌細胞系A2780等[1]，這顯然與WNT信號作用相矛盾，是否GSK-3在腫瘤細胞存在有其他信號機制發(fā)揮作用有待進一步研究證實。本研究以離體培養(yǎng)的A549人肺腺癌細胞株為實驗對象，通過不同濃度氯化鋰(LiCL)干預，觀察抑制GSK-3對腫瘤細胞的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌(A549)細胞株由四川大學華西醫(yī)學中心呼吸實驗室提供。DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；新生小牛血清購自成都哈里生物公司；LiCL為華北制藥廠產品；MTT試劑購自美國Sigma公司；SP超敏試劑盒購自福州邁新生物技術公司；NF-κBp65抗體購自長沙三創(chuàng)生物技術有限公司。主要儀器：NUAIRE超凈工作臺為蚌埠凈化設備廠產品，日本Olympus倒置光學顯微鏡，MS-352全自動酶標檢測儀。

1.2 方法 (1)取對數生長期的人肺癌A549細胞株，按1×104/孔、200μl/孔接種至96孔培養(yǎng)板后培養(yǎng)24h，細胞貼壁后加入100μl含培養(yǎng)液的不同濃度LiCl，并保證終濃度分別達到2.5mmol/L(實驗1組)、5mmol/L(實驗2組)、10mmol/L LiCl(實驗3組)，另設細胞對照組和空白對照組，每組均設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后加入MTT，用酶標儀測定490nm波長處吸光度(A)值，按下列公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率=(1-A490值/對照組A490值)×100%，實驗重復3次。

(2)將A549單細胞懸液接種于有血蓋片的六孔培養(yǎng)板中，每孔加入1×105個細胞，培養(yǎng)24h，待細胞完全貼壁時，棄原培養(yǎng)液，根據實驗需要實驗組加入不同劑量LiCl(均使用DMEM培養(yǎng)液溶解),使實驗1組、2組、3組終濃度分別達到2.5,5.0和10.0mmol/L,對照組加入等量DMEM培養(yǎng)基，置CO2孵箱中培養(yǎng)48h。磷酸鹽緩沖液洗滌；丙酮固定，免疫組化步驟參照說明書進行，陰性對照采用PBS代替一抗染色。

1.3 結果判定及分析 以細胞核呈明確的棕黃色為陽性染色，使用Nikon光學顯微鏡對切片觀察，用SPOT Cool CCD攝像頭進行圖像采集。用Image pro plus 4.10版本的專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析。每張切片在200倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野統計100個細胞中的陽性細胞數。

1.4 統計學分析 統計分析采用SPSS13.0軟件。實驗數據以均數±標準差(±s)表示，統計方法采用方差分析、x2檢驗等，P＜0.05表示差異有顯著性統計學意義，P＜0.01表示差異有非常顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 氯化鋰對A549細胞MTT值的影響 藍(MTT)檢測法顯示了活細胞能量代謝，反應細胞毒性反應。試驗組A549細胞分別與不同濃度的氯化鋰(2.5～10.0mmol/L)培養(yǎng)48h后,結果顯示各個實驗組的MTT值顯著低于對照組，差異有非常顯著的統計學意義(P＜0.01),試驗組中腫瘤細胞的生長與對照組比較呈劑量依賴關系,其中試驗3組細胞增殖抑制率達到48.03%,見表1及圖1、圖2。

2.2 LiCl對NF-κBp65表達的影響 各組A549細胞均顯示出NF-κBp65蛋白表達，主要在胞漿。使用LiCl處理48h后，實驗組A549細胞NF-κBp65蛋白表達明顯下降，與對照組相比，差異有顯著統計學意義(P＜0.05)。各實驗組之間NF-κBp65蛋白隨LiCl濃度上升而表達下降，各實驗組之間比較，其表達有明顯差異(P＜0.05)，見表2。

3 討論

鋰是人體非必要微量元素，近年來人們在大量體內外實驗中證實,鋰劑可對多種腫瘤細胞有抑制增殖和誘導凋亡作用，但其具體作用機制尚不明確。本實驗結果發(fā)現，以LiCl作用于A549肺癌細胞后，用MTT法發(fā)現A549細胞明顯凋亡增加且凋亡程度與LiCl濃度呈正相關。

表1 不同濃度氯化鋰對A549細胞毒性作用(±s)

表1 不同濃度氯化鋰對A549細胞毒性作用(±s)

注：a:與對照組比較，P＜0.01；b:與實驗3組比較，P＜0.01)；c:與實驗3組比較，P=0.06。

組別 MTT(mmol/L) 細胞增殖抑制率(%)對照組 2.54±0.28試驗1組 2.10±0.30abc 17.33實驗2組 1.75±0.23ab 31.11實驗3組 1.32±0.20a 48.03

表2 不同濃度LiCl對A549細胞iNOS蛋白表達的影響(±s)

表2 不同濃度LiCl對A549細胞iNOS蛋白表達的影響(±s)

注：a: 與對照組比較，P＜0.01;b:實驗各組間比較，P＜0.05。

組別iNOS陽性率(%)對照組 74.2±5.11實驗1組 62.4±2.88ab實驗2組 53.6±3.20ab實驗3組 34.8±3.27ab

NF-κB是屬于Rel家族的轉錄因子，參與調節(jié)與機體免疫、炎癥反應、細胞分化及凋亡有關的基因的轉錄。研究顯示，腫瘤細胞中存在NF-κB蛋白高表達，這也是腫瘤細胞與正常細胞區(qū)別之一[2]。Schwabe等[3]報道NF-κB系統在GSK-3抑制后，其活性受到抑制，并能有效增加肝細胞的凋亡。實驗結果表明，各實驗組LiCl作用于A549細胞48h后，NF-κBp65表達均明顯下降，與對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)，各實驗組間比較有顯著性差異(P＜0.05)；其水平隨LiCl濃度增加而降低，證明NF-κB系統受到抑制且與LiCl濃度相關，A549細胞產生的增殖抑制效果可能與此有關。使用氯化鋰抑制GSK-3后抑制腫瘤細胞增殖表明，其作用機制是通過抑制NF-κB信號系統發(fā)揮作用，而WNT信號途徑作用并不明顯。

圖1 不同濃度LiCl體外作用A549細胞48h后MTT值的影響

圖2 不同濃度LiCl對A549細胞增殖抑制 率的影響

[1]鐘梅,吳易元,朱巖,等.鋰誘導腫瘤細胞凋亡及其機理初探[J].中華微生物學和免疫學雜志,1998,18(1):5-11.

[2]Tsutomu S,Toyokazu M,NavRi W,et al.Nuclear factor-κB dependent exression of metastasis suppressor KAI1/cd82 gene in lung cancer cell lines expressing mutant p53[J].Cancer Res,2001,61(8):673-678.

[3]Schwabe RF,brenner DA.Role of glycogen synthase kinase-3 in TNF--induced NF-B activation and apoptosis in hepatocytes[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,283(1):204-211.