張海燕,屈晨雪,王建中*,張曉輝,付海霞,汪 潤(rùn),袁家穎

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100034;2.北京大學(xué)人民醫(yī)院 血液科)

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是臨床出血性疾病的常見(jiàn)病和多發(fā)病,患者血小板顯著減少,嚴(yán)重者出現(xiàn)自發(fā)性出血并可危及生命。最新的研究表明,ITP的發(fā)病不僅與抗血小板自身抗體導(dǎo)致的血小板破壞過(guò)多有關(guān),還與自身抗體介導(dǎo)的巨核細(xì)胞發(fā)育異常和CD8+T細(xì)胞抑制巨核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[1]。諸多體外試驗(yàn)已證實(shí),ITP患者的血漿能明顯抑制巨核細(xì)胞的生成和成熟度是導(dǎo)致其血小板生成減少的重要因素[2]。然而,到目前為止,對(duì)于ITP患者體內(nèi)骨髓巨核細(xì)胞在分化發(fā)育過(guò)程中的變化,尤其是對(duì)不同DNA倍體巨核細(xì)胞功能蛋白表達(dá)的研究了解甚少。本研究主要通過(guò)建立人骨髓流式巨核細(xì)胞分析的臨床實(shí)用新方法,初步探討ITP患者巨核細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中數(shù)量與糖蛋白表達(dá)水平的變化,進(jìn)一步闡明ITP的發(fā)病機(jī)制,從而為ITP的實(shí)驗(yàn)診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

15例骨髓移植健康供者作為對(duì)照組(NOR),女性5例,男性9例,年齡20-55歲;37例ITP,其中初發(fā)患者29例和治療后未緩解患者8例,男性9例,女性28例,年齡15-81歲。所有病例均符合ITP臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[3];11例繼發(fā)性血小板減少癥(ST組),其中6例白血病骨髓移植后,5例其他病因引起的ST(甲狀腺機(jī)能減退癥1例,巨幼細(xì)胞性貧血2例,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎1例,再生障礙性貧血1例)。

1.2 儀器和試劑

FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD公司);HERMLE-Z383K型離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司);異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗血管性血友病因子(vWF)多克隆抗體 (美國(guó)AbD公司);別藻青蛋白(APC)標(biāo)記的CD41a單克隆抗體(美國(guó)BD公司);FITC標(biāo)記的抗CD42a單克隆抗體(美國(guó)BD公司);APC標(biāo)記的抗P-選擇素(CD62P)單克隆抗體(美國(guó)BD公司);標(biāo)準(zhǔn)微球(CaliBRITE beads)(美國(guó)BD公司);碘化丙錠(PI)(美國(guó)Sigma公司);Percoll細(xì)胞分離液(美國(guó)GE公司);透膜液(PERM)(美國(guó)BD公司);OLYMPUS顯微鏡等。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 骨髓穿刺液2 ml,加入含EDTA(終濃度為1.5 mg/ml)的抗凝管中。

1.3.2 巨核細(xì)胞計(jì)數(shù) 取3 μ l抗凝骨髓液涂片,用瑞-姬染液染色,光學(xué)顯微鏡低倍鏡下計(jì)數(shù)3 μ l骨髓液涂片中全部巨核細(xì)胞的數(shù)量,并在油鏡(1000×)下確認(rèn)。

1.3.3 巨核細(xì)胞分離富集 用等滲的Percoll和磷酸鹽緩沖液(PBS)將骨髓中有核細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至20×106個(gè),并將其Percoll密度調(diào)至1.020 g/mL,將配好的1.020 g/mL骨髓液緩緩加在2 ml密度為1.055 g/ml Percoll分離液上方,然后再加入2 ml PBS,400 g離心20 min,吸取Percoll分離液上面的灰白色細(xì)胞層,移至另一個(gè)試管中,加1.5倍體積的PBS,300 g離心10 min,棄上清。留取細(xì)胞沉淀待用。

1.3.4 巨核細(xì)胞的免疫熒光染色 將富集好的巨核細(xì)胞懸液用PBS調(diào)成(2-3)×106/ml,加入透膜液 500 μ l,混勻 ,室溫放置 10 min,加入2 mL PBS 450 g,離心 5 min。棄上清。分別加入 CD41a-APC 5 μ l、vWF-FITC 5 μ l、CD62P-APC 5 μ l,混勻 ,室溫下避光 20 min。加2 ml PBS,100 g離心7 min。棄上清。加入RNase 100 μ l,放入37℃水浴箱中孵育30 min。將細(xì)胞懸液調(diào)整 500 μ l左右,加入 5 mg/ml PI染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)微球(CaliBRITE beads)校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀光路、電壓及補(bǔ)償。采用側(cè)向角散射光(SSC)和糖蛋白標(biāo)記的熒光強(qiáng)度(CD41a-SSC,vWF-SSC)作圖,獲取 500 000-1 000 000個(gè)細(xì)胞。在CD41a-PI、vWF-PI雙參數(shù)散點(diǎn)圖中,分別以CD41a、vWF陽(yáng)性信號(hào)設(shè)門(mén)后分析巨核細(xì)胞DNA倍體分布百分率和不同倍體各種糖蛋白的表達(dá)水平,后者以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示蛋白表達(dá)量,相對(duì)熒光強(qiáng)度為各種糖蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度除以其陰性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

三組巨核細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量、巨核細(xì)胞DNA倍體百分率、糖蛋白CD41a、vWF、CD62P在各個(gè)DNA倍體上的表達(dá)量用均數(shù)(ˉx)±標(biāo)準(zhǔn)差(S)表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn);滿足單因素方差分析條件進(jìn)行單因素方差分析,然后進(jìn)行Multiple Comparisons LDS兩組之間分析;否則采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn),然后進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn),比較兩組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組人群靜脈血血小板數(shù)量(PLT)與骨髓涂片巨核細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量

結(jié)果顯示ITP組和ST組的PLT與對(duì)照組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。三組之間骨髓巨核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三組人群血小板數(shù)量與骨髓巨核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量比較

2.2 骨髓富集前后巨核細(xì)胞DNA倍體比較

富集和未富集的骨髓標(biāo)本同時(shí)標(biāo)記CD42a-FITC和PI,流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)兩種標(biāo)本,收獲500 000個(gè)細(xì)胞,以CD42a-PI雙參數(shù)作圖分析巨核細(xì)胞DNA倍體,比較富集前后DNA倍體。結(jié)果顯示未富集標(biāo)本中巨核細(xì)胞少,DNA倍體分布不明顯;富集后巨核細(xì)胞比例顯著增多,且倍體分布明顯、清晰。其中1例對(duì)照標(biāo)本未富集時(shí),巨核細(xì)胞約占0.06%;富集后巨核細(xì)胞占1.02%;增多了17倍。

2.3 兩種標(biāo)志物分析巨核細(xì)胞DNA倍體和蛋白表達(dá)量水平比較

以vWF-SSC或CD41a-SSC收獲骨髓巨核細(xì)胞,vWF或CD41a陽(yáng)性設(shè)門(mén)R1。以vWF-PI做圖分析巨核細(xì)胞(R1)中各倍體的分布百分率,同時(shí)分析各倍體的vWF或CD41a的表達(dá)量。ITP組分別以vWF和CD41a設(shè)門(mén)時(shí),各倍體巨核細(xì)胞百分率與對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05)。ST組以 vWF設(shè)門(mén),在 4N、8N時(shí),DNA倍體百分率高于ITP組和對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以CD41a設(shè)門(mén),16N時(shí),ST組明顯低于對(duì)照組和ITP組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2,表3。

表2 用vWF設(shè)門(mén)三組巨核細(xì)胞在各個(gè)倍體百分率比較

表3 用CD41a設(shè)門(mén)三組巨核細(xì)胞在各個(gè)倍體百分率比較

2.4 巨核細(xì)胞CD41a、vWF及CD62P在各倍體巨核細(xì)胞的表達(dá)水平

對(duì)照組骨髓巨核細(xì)胞CD41a、vWF、CD62P表達(dá)量隨DNA倍體的增加而升高,32N達(dá)峰值。ITP組骨髓巨核細(xì)胞CD41a表達(dá)量在 2N、4N、8N、16N、32N、64N等倍體明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而與ST組相比,ITP組巨核細(xì)胞的CD41a表達(dá)量增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ITP組骨髓巨核細(xì)胞的vWF表達(dá)量低于對(duì)照組,在32N時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ITP組骨髓巨核細(xì)胞的vWF表達(dá)量低于對(duì)照組,高于ST組,但差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05),僅在32倍體時(shí)的差異有顯著意義(P=0.018)。各倍體巨核細(xì)胞CD62P的表達(dá)量在三組之間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。三組數(shù)據(jù)比較見(jiàn)表4、表5、表6。

表4 三組人群巨核細(xì)胞CD41a表達(dá)量比較

表5 三組人群巨核細(xì)胞vWF表達(dá)量比較

表6 三組人群巨核細(xì)胞CD62P表達(dá)量比較

3 討論

傳統(tǒng)的ITP發(fā)病機(jī)制主要是由于患者體內(nèi)的自身抗體與血小板結(jié)合,導(dǎo)致血小板被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)過(guò)度破壞而導(dǎo)致血小板減少。然而,抗體介導(dǎo)的血小板減少并不能解釋所有ITP患者血小板減少的病因:①并非所有ITP患者的血漿/血清能引起正常人血小板減少;②血小板自身抗體只能在50%-70%的ITP患者中檢測(cè)到;③部分患者病情的緩解與體內(nèi)抗體的水平無(wú)相關(guān)性。這些均提示ITP患者體內(nèi)可能還存在其他引發(fā)血小板減少的機(jī)制[1]。

由于巨核細(xì)胞在骨髓中所占比例極低(占骨髓有核細(xì)胞的0.05%),以前的大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道主要都是用體外培養(yǎng)巨核細(xì)胞株的研究。本研究采用Percoll密度梯度離心法富集巨核細(xì)胞,克服了巨核細(xì)胞數(shù)量少的缺點(diǎn)。結(jié)果顯示富集后巨核細(xì)胞數(shù)量增加可達(dá)17倍,而且更易看到其多倍體性;未富集標(biāo)本巨核細(xì)胞的數(shù)量較少,倍體分布也不明顯。富集前后相比,DNA倍體分布相似,無(wú)明顯的差異[4]。

在ITP患者中,針對(duì)CD41a(GPIIb/IIIa)的自身抗體最常見(jiàn),故試驗(yàn)中選擇了糖蛋白CD41a和對(duì)幼稚巨核細(xì)胞更敏感的vWF作為觀察指標(biāo)[5]。此外標(biāo)記時(shí),采用透膜后標(biāo)記CD41a,這樣能同時(shí)標(biāo)記巨核細(xì)胞膜表面及胞質(zhì)中CD41a分子,更加全面反映巨核細(xì)胞CD41a的合成水平,也排除了在低倍體2N、4N時(shí)血小板粘附的影響,使巨核細(xì)胞的識(shí)別更加特異。

體外研究發(fā)現(xiàn)部分自身抗體陽(yáng)性ITP患者的血漿的確能抑制巨核細(xì)胞生成的數(shù)量和成熟度;骨髓檢查顯示多數(shù)患者骨髓巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)不增多,甚至減少?？赡苁亲陨砜贵w抑制了巨核細(xì)胞的生成[6,7]。

正常巨核細(xì)胞倍體分布是以16倍體為主,其次是8倍體和32倍體。16N約占50%,大于16N和小于16N的倍體約占50%。本研究對(duì)照組的巨核細(xì)胞DNA倍體分布基本正常。ITP組巨核細(xì)胞的倍體分布與對(duì)照組基本相同,各倍體巨核細(xì)胞數(shù)量并無(wú)差異(P＞0.05)。分析其原因可能是ITP時(shí)抗血小板糖蛋白自身抗體與巨核細(xì)胞結(jié)合后,僅對(duì)巨核細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響,而對(duì)細(xì)胞DNA未產(chǎn)生影響,因此DNA倍體分布不發(fā)生偏移[4]。此外,本研究顯示ST組在4N、8N時(shí)巨核細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組和ITP組(P＜0.05),這可能是因?yàn)樵摻M近50%的標(biāo)本來(lái)自白血病骨髓移植后血小板減少,患者幼稚巨核細(xì)胞較多,從而造成了4N和8N增多,而16N減少。

CD41a是巨核細(xì)胞合成的與血小板聚集功能相關(guān)的糖蛋白,生理狀況下隨著巨核細(xì)胞DNA倍體的增加而表達(dá)增高。本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):ITP患者各個(gè)倍體巨核細(xì)胞的CD41a表達(dá)規(guī)律與對(duì)照組相同,但在巨核細(xì)胞發(fā)育的整個(gè)階段(2N-64N)中,ITP患者CD41a表達(dá)量明顯高于正常人(P＜0.05),其原因可能是ITP時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的抗CD41a的自身抗體使血小板CD41a被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞[8,9],機(jī)體為了維持其正常的血小板聚集功能而使巨核細(xì)胞合成更多的CD41a,以滿足血小板功能需要。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看這種代償從原始巨核細(xì)胞階段開(kāi)始,貫穿巨核細(xì)胞發(fā)育整個(gè)過(guò)程。因此,可以推測(cè)ITP時(shí),骨髓巨核細(xì)胞為了代償其功能而發(fā)生糖蛋白CD41a表達(dá)的異常。同時(shí)ITP患者CD41a表達(dá)量也高于ST組,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05),究其原因可能是由于ST組標(biāo)本例數(shù)偏少所致無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;也可能是ST患者巨核細(xì)胞也會(huì)代償?shù)禺a(chǎn)生更多的CD41a,但是不如ITP那么強(qiáng)。

vWF是血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓巨核細(xì)胞合成的一種糖蛋白[10],vWF的表達(dá)量在對(duì)照組隨著巨核細(xì)胞倍體增加而升高,但I(xiàn)TP患者巨核細(xì)胞的vWF表達(dá)量低于對(duì)照組,尤其在高倍體(32N)減低更顯著(P＜0.05)。電鏡檢查發(fā)現(xiàn)ITP時(shí)患者骨髓巨核細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,形成胞質(zhì)內(nèi)空泡增多等[11],可能使巨核細(xì)胞質(zhì)中vWF的合成受到影響;由于成熟巨核細(xì)胞vWF合成量是不成熟巨核細(xì)胞的7.5倍[12],故ITP時(shí)高倍體的巨核細(xì)胞vWF合成減少更明顯。繼發(fā)性血小板減少癥巨核細(xì)胞vWF合成也有降低,可能主要是該組中用一半是骨髓移植后患者,骨髓還處于抑制階段,故vWF合成較少。

CD62P是巨核細(xì)胞內(nèi)α顆粒膜糖蛋白,在ITP組各倍體巨核細(xì)胞的CD62P表達(dá)量與對(duì)照組比較并無(wú)明顯變化,這與形態(tài)學(xué)觀察到的巨核細(xì)胞內(nèi)顆粒減少不盡一致。由于CD62P在巨核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中成熟,再跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)分類,最后被運(yùn)輸?shù)溅令w粒[13]。在未成熟的巨核細(xì)胞中,CD62P和vWF是共定位的[14],因此兩者在三組人群低倍體巨核細(xì)胞的表達(dá)均沒(méi)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在成熟的巨核細(xì)胞中,CD62P和vWF在定位在不同的α顆粒[14],CD62P在三組人群之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義,可能提示CD62P所存在的α顆粒是正常的,或者巨核細(xì)胞質(zhì)中CD62P的合成的總量是正常的。vWF在高倍體巨核細(xì)胞(32N)中顯著減低,提示ITP時(shí)成熟巨核細(xì)胞合成vWF的總量減低,或所存在的α顆?？赡艽嬖诋惓?。

綜上所述,本研究建立了流式細(xì)胞術(shù)分析人骨髓巨核細(xì)胞倍體和糖蛋白表達(dá)水平的新方法,并使其有了臨床可用性。同時(shí)探討了ITP疾病狀態(tài)下骨髓巨核細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中DNA倍體和糖蛋白表達(dá)量的變化,表明ITP患者骨髓巨核細(xì)胞的數(shù)量和DNA倍體并未受到影響,但功能蛋白的合成卻有顯著變化,尤其是與血小板聚集和粘附功能相關(guān)的糖蛋白CD41a在絕大多數(shù)不同倍體的巨核細(xì)胞中合成顯著增高,vWF在高倍體成熟巨核細(xì)胞中合成明顯降低,CD62P維持在正常水平,為進(jìn)一步闡明ITP的發(fā)病機(jī)制、診斷與治療等研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝:北京道培醫(yī)院武平、童春榮大夫,北京大學(xué)第一醫(yī)院血液內(nèi)科尹悅大夫?yàn)楣撬铇?biāo)本采集提供了幫助,在此一并致謝!

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