王 琛,尤 昕,姜春善,柳明洙,崔鮮花,金春花,金春梅

(1.延邊大學附屬醫(yī)院 檢驗科,吉林延吉133000;2.延邊大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室)

Nelin基因是在構(gòu)建正常成人的心臟cDNA文庫及大規(guī)模篩選表達序列標簽的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的,是一個肌組織特異表達的新基因[1,2]。其編碼與大鼠肌動蛋白結(jié)合蛋白的基因Nexilin高度同源[3],其中間近N端(76-242aa之間)有一典型的F-actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域,現(xiàn)已證實與F-actin結(jié)合的特性,為一新的肌動蛋白結(jié)合蛋白[4,5],具有刺激細胞遷移和黏附的作用[6]。為了進一步研究Nelin基因的遺傳特征和與疾病的關(guān)聯(lián),本研究對延邊地區(qū)健康人群Nelin基因外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究對象 抽取經(jīng)知情同意的114例體檢的健康者EDTA-K2抗凝全血1 ml,朝鮮族男性27例,朝鮮族女性24例,漢族男性32例,漢族女性31例。

1.1.2 儀器與試劑 AxyPrep全血基因組DNA小劑量試劑盒購自北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司,PCR擴增試劑盒、DL2000 DNA分子量標準購自TaKaRa公司。

1.1.3 引物 針對Nelin基因第7、8、9、11四個外顯子,應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計3對引物(由于該基因第7內(nèi)含子僅有104個堿基,因此將第7外顯子、第7內(nèi)含子和第8外顯子設(shè)計成一個片段進行擴增),由北京奧科公司合成。序列如下:擴增第7-8外顯子片段所用引物為上游引物:5'-TGATGGAGGTAAAGTCCCAT-3',下游引物:5'-GTAGATTTACCAT TTGCCGC-3',片段長度:563 bp。擴增第9外顯子片段所用引物為上游引物:5'-CCTGTGTGATA GTGGCTAAT-3',下游引物:5'-GCAAATACCTTCAACCAACT-3',片段長度:463 bp。擴增第11外顯子片段所用引物為上游引物:5'-GATTGCTTAAACACAGGAAT-3',下游引物:5'-TGCTATTT ACT TCCCAGATT-3',片段長度:454 bp。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取用AxyPrep血基因組DNA小劑量試劑盒提取。

1.2.2 目的片段DNA擴增 以提取的基因組DNA為模板,用Taq DNA聚合酶進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件(三個片段反應(yīng)條件相同):25 μ l體系,96℃預(yù)變性3 min,96℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,循環(huán)35次,72℃延伸2 min,4℃2 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的測序 由上海申速公司進行測序,應(yīng)用DNAman軟件ClustalW2工具進行序列分析與Genbank的Nelin基因序列對比分析。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 根據(jù)H-W平衡定律計算SNP位點的基因型頻率,利用χ2檢驗比較觀察到的基因型頻率與預(yù)期基因型頻率之間的差異。應(yīng)用統(tǒng)計學軟件SPSS11.5進行 χ2檢驗;設(shè)定顯著性意義水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 擴增結(jié)果 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示第7-8外顯子的擴增片段約為563 bp,第9外顯子的擴增片段約為463 bp,第11外顯子的擴增片段約為454 bp,與預(yù)期分子量相符(圖1)。

2.2 Nelin基因片段測序結(jié)果 通過對4個外顯子的測序分析,發(fā)現(xiàn)2個SNP位點,其中1個為NCBI數(shù)據(jù)庫中報道的rs1166698位點,1個為新發(fā)現(xiàn)的位點,NCBI數(shù)據(jù)庫中報道的本研究人群中沒有發(fā)現(xiàn)的位點3個。

2.3 rs1166698位點結(jié)果分析 rs1166698位點為第8外顯子區(qū)G-A錯義突變(圖2),其基因型頻率為GG:31.6%,GA:52.6%,AA:15.8%,等位基因頻率為G:57.9%,A:42.1%。通過對延邊地區(qū)人群該位點的民族、性別比對分析,基因型、等位基因頻率在朝漢族、男女的分布無明顯差異(表1)。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 rs1166698 SNP位點的測序結(jié)果

表1 Nelin基因 SNP位點(rs1166698)民族、性別、基因型和等位基因頻率分布

2.4 新發(fā)現(xiàn)的SNP 新發(fā)現(xiàn)的SNP是第9外顯子區(qū)A/G錯義突變1195 A/G,密碼子由AAA突變?yōu)镚AA(圖3),編碼的賴氨酸轉(zhuǎn)換為谷氨酸,野生基因型AA占88.6%(101/114),突變基因型AG為11.4%(13/114),未發(fā)現(xiàn)突變純合子基因型。

3 討論

Nelin為一個新的肌動蛋白結(jié)合蛋白[3],其基因功能目前還不明確,最近的研究表明,Nelin具有刺激細胞遷移和黏附的作用[6],在細胞肥大、心肌缺血預(yù)適應(yīng)模型中表達量增加[7,8],基因突變與擴張性心肌病相關(guān)[9],提示該基因在心臟的多種病理生理過程中起重要作用。在NCBI數(shù)據(jù)庫最新登記的Nelin基因的人類SNP共有279個(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/SNP),有8個cSNP,在 8個 cSNP中包括 1個同義SNP,一個單堿基插入突變,6個錯義SNP。本研究所針對的是肌組織特異表達的Nelin基因,該基因的結(jié)構(gòu)包含數(shù)據(jù)庫中的NEXN基因的第7-第13外顯子,在第8、9、11外顯子區(qū)有 4個錯義SNP。由于第7內(nèi)含子僅有104堿基,因此本研究將第7與第8外顯子作為一個片段,加上第9、11外顯子共三個片段進行擴增和序列分析研究。

通過對4個外顯子SNP位點的序列分析,發(fā)現(xiàn)2個SNP位點,其中 1個為NCBI數(shù)據(jù)庫中報道的rs1166698位點,另一個是新發(fā)現(xiàn)的第9外顯子區(qū)A/G錯義突變1195 A/G。rs1166698位點為第8外顯子區(qū)G-A錯義突變(48364365 G/A),密碼子由GGA突變?yōu)锳GA,編碼的甘氨酸(Gly)轉(zhuǎn)換為精氨酸(Arg),此位點恰好位于基因的一個核定位信號區(qū)域。通過對延邊地區(qū)人群該位點的分析,其基因型頻率為GG:31.6%,GA:52.6%,AA:15.8%,等位基因頻率為G:57.9%,A:42.1%。該位點的基因型、等位基因頻率與朝漢民族、男女性別的分布無關(guān)聯(lián)。與歐洲人、北京漢族人群、東京的日本人群的對比分析,結(jié)果顯示,延邊地區(qū)健康人群Nelin基因多態(tài)位點rs1166698(基因型GG/GA/AA,等位基因G/A)的分布與歐洲人有顯著差異。與中國北京的漢族人群比較有一定的差異,但差異不明顯,與東京日本人比較差異非常小,基因型分布和等位基因頻率非常接近(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/SNP)。

綜上所述,通過研究我們了解了延邊地區(qū)Nelin基因相關(guān)SNP位點遺傳分布特征,發(fā)現(xiàn)了一個新的突變位點。rs1166698位點位于基因的核定位信號區(qū)域,推測其對基因的功能會產(chǎn)生一定影響,因此,Nelin基因相關(guān)位點單核苷酸多態(tài)性分析研究,為接下來研究Nelin基因與疾病的關(guān)系,尋找新的疾病易感遺傳標記奠定了基礎(chǔ)。

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