高利增,王雪梅,王立成,孫曉莉,李 惟,王麗萍,

(1.吉林大學生命科學學院,吉林長春130021;2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院,北京100053;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林長春130033)

干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節(jié)作用的重要的細胞因子。根據(jù)對干擾素基因核酸序列分析結果表明,它于5-10億年前即于生物學細胞中存在。是生物體內一類古老的保護因子。自它發(fā)現(xiàn)以來,大量的臨床研究表明,干擾素在抗病毒性疾病和惡性腫瘤以及增強機體免疫調節(jié)能力方面有明顯效果[1,2]。而且,隨著分子生物學及DNA重組技術的迅速發(fā)展,已經應用基因工程技術為人類抗腫瘤、病毒生產出大量高效的干擾素。制備高純度的重組干擾素通常采用單克隆抗體親和層析的方法[3-5]。

1 材料與方法

1.1 親和層析介質的制備 Sepharose 4B的懸浮:取CNBr活化的Sepharose 4B干粉(1克干粉可得濕樹脂3.5 ml),用1 mM HCl溶解,并立即用1 mM HCl沖洗,每克樹脂需200 ml,抽濾進行,約需15 min。(注:1 mMHCl必須抽濾徹底,盡量減少其存留量,以免影響偶聯(lián)反應)。

配體偶聯(lián):取配體溶于Coupling Buffer中,每毫升樹脂需配體的量為5-10 mg,Coupling Buffer用量為5 ml/g(樹脂干粉)。把溶有配體的Coupling Buffer與懸浮完畢的濕樹脂混合,進行偶聯(lián)反應,反復振搖,室溫下1 h或4℃過夜。反應完畢后用5倍樹脂體積的Coupling Buffer洗去未反應的配體。掩埋剩余活性位點:將樹脂轉移到0.1MTris-HCl(pH8.0)中室溫反應2 h。樹脂洗滌處理:將上述樹脂洗滌三輪,每輪用高低pH洗滌液交替洗滌,洗滌液用量為樹脂體積的5倍。樹脂處理完畢后,用上樣緩沖液洗滌3次后即可使用。

1.2 親和層析純化干擾素 樹脂的平衡:將樹脂裝柱后用3倍體積的上樣緩沖液平衡。

上樣:將含有一定濃度干擾素的上樣緩沖液上柱,使干擾素與樹脂發(fā)生特異性吸附。

非特異性洗滌:用3-5倍樹脂體積的洗滌液洗滌樹脂,去除非特異性吸附的雜質。

特異性洗脫:用1-3倍樹脂體積的特異性洗脫液洗脫,并隨時檢測流出液的蛋白濃度,收集蛋白濃度較高時的流出液。

蛋白純度的鑒定:純化的蛋白經SDS-PAGE和HPLC分析,確定蛋白的純度。

1.3 親和層析介質純化干擾素能力的評估 通過實驗數(shù)據(jù)分析,得到這種方法純化干擾素的指標,包括蛋白收率、純化容量、純化效率、可行性評估。

2 結果

2.1 親和層析介質的制備

CNBr活化的Sepharose 4B樹脂,與偶聯(lián)的六肽配體的用量是10 mg小肽/1 g樹脂。樹脂與配體的偶聯(lián),小肽與蛋白是不同的,一般來說,肽配體的偶聯(lián)量要高于蛋白配體,而且偶聯(lián)效率也較高。實驗中我們發(fā)現(xiàn),介質的純化能力和容量與偶聯(lián)的六肽配體的多少直接相關,在樹脂的量一定時,偶聯(lián)的六肽越多,親和層析介質純化干擾素的容量就越大。

在六肽配體與樹脂發(fā)生偶聯(lián)反應時,將反應前和反應后的反應液在紫外下掃描,檢測小肽的變化,從而確定偶聯(lián)效率。實驗中發(fā)現(xiàn),當小肽的用量高達10 mg/g樹脂時,偶聯(lián)的效率仍可達99%(圖1),從而說明親和層析介質的制備比較成功。

本實驗所用的六肽配體共有三種構型:L、1D和6D。L構型六肽是從噬菌體六肽庫篩選得到的與干擾素α 2a特異性結合的肽配體。最初將L配體偶聯(lián)于磁珠載體用于純化干擾素,但發(fā)現(xiàn)這種親和層析介質在反復使用幾次后,純化能力大大下降,經分析認為是在使用過程中六肽配體遭到酶解,為了防止肽配體的降解,于是又合成了1D和6D兩種配體(表1),其依據(jù)的理論基礎是肽配體構型改變后,不再是天然存在的L-構型氨基酸,可以抵抗蛋白酶的降解;同時考慮到以磁珠作親和層析載體比較昂貴,不適合工業(yè)生產,需要尋找更普遍的材料作載體,因而又從 Phamacia公司購買了 CNBr活化的Sepharose 4B樹脂作載體。實驗中發(fā)現(xiàn)這三種小肽與樹脂的偶聯(lián)效率相當,說明小肽中氨基酸構型的改變不影響偶聯(lián)效率。

圖1 六肽與樹脂的偶聯(lián)反應圖譜

表1 三種肽的氨基酸序列

2.2 親和層析純化干擾素

通過分析六肽配體的氨基酸序列,我們發(fā)現(xiàn)其氨基酸構成以疏水性氨基酸為主,因而推測六肽配體與干擾素的結合以特異性的疏水相互作用為主,依據(jù)疏水相互作用與溶液的體系的鹽濃度相關的原理,我們把實驗條件的摸索重點放在了離子強度方面,同時摸索了最適pH值。

實驗中發(fā)現(xiàn),當上樣緩沖液pH值在6.0-7.5之間變化時,干擾素與樹脂的吸附效率變化不大,所以選擇pH 7.0作為以后最適pH,洗滌液同樣對pH值的變化不敏感,洗脫液在pH 2.5-4.0之間均可將吸附的蛋白洗下,但pH值越小,洗脫效果越好;但是,當上樣緩沖液中PBS的鹽濃度在0.1-2M之間變化時,蛋白的吸附效率變化極為敏感,隨著鹽濃度的升高,蛋白的吸附效率也隨之升高,但非特異性吸附雜志也增加,當洗滌液鹽濃度略低于上樣緩沖液時,洗滌效果非常明顯,洗滌下來的雜質除非特異性吸附的雜質外,還包括一部分干擾素,從而證明六肽配體與干擾素的結合為特異性疏水相互作用;洗脫液在0.1M、pH2.5-4.0之間可將吸附的蛋白洗脫充分。依據(jù)上述變化規(guī)律我們最后確定的實驗條件是:上樣緩沖液2.0M、pH7.0,洗滌液1.8-2.0M、pH7.0,洗脫液 0.1M 、pH2.5-4.0。

2.3 親和層析介質純化干擾素能力的評估

根據(jù)1.2中總結得到的實驗條件,利用此種親和層析介質純化干擾素,干擾素原液是經包含體變性復性后的透析液,經此純化后,蛋白的收率高達85%(圖2)。蛋白純度達90%,HPLC鑒定(圖3)。在純化過程中,對洗滌液和洗脫液中的蛋白進行實時跟蹤監(jiān)測,流出液中的蛋白變化與預期相符。蛋白純化過程的變化見圖4。

圖2 干擾素α-2a純化結果

圖3 干擾素α-2a純化后的 HPLC

圖4 干擾素α-2a純化的實時監(jiān)測

3 討論

與制藥工業(yè)生產的干擾素相比,用此種方法純化得到的干擾素雖然純度偏低,不能作為藥物使用,但它作為親和層析純化方法,與傳統(tǒng)的純化方法相比,更為快速,簡單方便,所需的步驟較少,蛋白的收率也較高;同時,以小肽作為親和配體,與以單克隆抗體作為配體相比,前者純化獲得產品污染少,不會象單克隆抗體從介質脫落混入產品進而在人體引發(fā)抗原抗體反應。總之,以六肽作為親和配體,為純化干擾素提供了一個新的方法,本實驗對此方法進行了初步的探索,為此方法將來的應用打下了基礎。

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