張 輝,曹 劍,劉 飆,尹維田

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手外科,吉林長春130033)

本文應(yīng)用蘇木乙醇提取物(SME)作用于坐骨神經(jīng)損傷Balb/c小鼠,擬通過髓鞘堿性蛋白的測定和神經(jīng)電生理功能評定,研究蘇木乙醇提取物在促進(jìn)周圍神經(jīng)再生方面的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

健康雄性健康雄性Balb/c小鼠84只,體重18-22 g(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心),隨機(jī)分為蘇木醇提物高中低劑量組及生理鹽水對照組。各按術(shù)后3天、5天、1周、2周,4周、8周、12周分為 7個時間點(diǎn),每個時間點(diǎn)12只。主要試劑:蘇木乙醇提取物(SME)購自陜西昌岳植化技術(shù)公司,小鼠髓鞘堿性蛋白(MBP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自Rapidbio公司。

1.2 模型制備與給藥

1%硫噴妥鈉100 mg/kg腹腔麻醉小鼠,術(shù)區(qū)常規(guī)消毒,做右側(cè)臀部斜行切口,鈍性分離肌肉,暴露坐骨神經(jīng)。在坐骨結(jié)節(jié)下0.5 cm處完全切斷神經(jīng)干,12倍手術(shù)顯微鏡下將斷端對位后以11-0無損傷線吻合斷端兩針,逐層閉合創(chuàng)口。

給藥方法和劑量:采取灌胃方法給藥。參照臨床應(yīng)用蘇木原藥劑量,等效換算為小鼠灌胃用劑量[5],將此數(shù)值作為給藥的中等劑量,并以等比數(shù)列量確定高低劑量組用量。最終各組給藥量為,高劑量組16 g/kg/d,中劑量組8 g/kg/d,低劑量組4 g/kg/d,取相應(yīng)劑量蘇木乙醇提取物以生理鹽水溶解后灌胃。對照組給予同等體積生理鹽水。連續(xù)給藥至處死。

1.3 ELISA法測定小鼠髓鞘堿性蛋白(MBP)

按時間點(diǎn)順序,每組取小鼠3只,眼球取血約0.5 ml,于Ep管中常溫靜置2 h后4℃冰箱過夜,次日5 000 r/min離心3 min,取上層血清,儲存于-20℃冰箱備用,待所有動物取材完畢后同時進(jìn)行ELISA測定。方法嚴(yán)格遵照試劑盒說明書。

1.4 神經(jīng)電生理檢測

應(yīng)用Medtronic Keypoint肌電/誘發(fā)電位儀,4、8、12周時實(shí)驗(yàn)動物雙側(cè)坐骨神經(jīng)均作檢測,主要觀察動作電位波幅(AMP)和運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)的變化。檢測方法:1%硫噴妥鈉腹腔麻醉動物后,無菌消毒術(shù)野,俯臥位暴露坐骨神經(jīng)總干,同芯針電極刺入小鼠比目魚肌肌腹內(nèi)作為記錄電極,接地電極置于鼠尾部,以平行刺激電極分別于吻合口近側(cè)坐骨結(jié)節(jié)水平及遠(yuǎn)側(cè)坐骨神經(jīng)分支處給以超強(qiáng)刺激(電流10 mA),游標(biāo)卡尺測量并輸入刺激電極間距離,計算得出運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)。室溫控制在24攝氏度。運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度=兩刺激電極間距離/動作電位潛伏期差值(傳導(dǎo)時間)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件對各時間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間 t檢驗(yàn),P＜0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 髓鞘堿性蛋白酶聯(lián)免疫分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。各時間點(diǎn)血清MBP濃度對比結(jié)果見表1,高中低劑量組分別與對照組行組間 t檢驗(yàn),P＜0.05時存在顯著差異。

圖1 MBP ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為Y=1/(19.050-10.753X0.06)

表1 各時間點(diǎn)動物MBP濃度對比結(jié)果

2.2 神經(jīng)電生理檢測 4、8、12周各時間點(diǎn)電生理檢測結(jié)果見表2,高中低劑量組分別與對照組行組間t檢驗(yàn),P＜0.05時存在顯著差異。

表2 4、8、12周各時間點(diǎn)電生理檢測結(jié)果 P＜0.05存在顯著性差異

3 討論

關(guān)于周圍神經(jīng)損傷后局部免疫反應(yīng)對神經(jīng)再生的影響以及應(yīng)用免疫抑制劑促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的機(jī)制已經(jīng)有許多相關(guān)研究[7-9]。近年的重點(diǎn)則集中于免疫抑制劑FK506,1994年Gold[10]首先報道FK506能提高大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后的軸突再生率之后,國內(nèi)學(xué)者在2000年發(fā)現(xiàn)在異體手移植術(shù)后聯(lián)合應(yīng)用FK506的過程中,移植手的神經(jīng)生長速度快于同平面自體斷肢再植[11]。此后的一系列研究使FK506促進(jìn)神經(jīng)再生的作用得到了普遍的認(rèn)可[12,13]。

然而FK506造價高昂的同時又不乏免疫抑制類藥物的副作用。本文通過對蘇木乙醇提取物的研究,已經(jīng)確定了SME對坐骨神經(jīng)損傷Balb/c小鼠的免疫功能存在顯著的抑制作用,且存在明確的量效關(guān)系。本文進(jìn)一步的研究結(jié)果證明,通過抑制損傷后的免疫反應(yīng),SME可以降低神經(jīng)損傷局部的破壞程度,從而加速神經(jīng)再生。本研究作為一個應(yīng)用中藥提取物抑制免疫反應(yīng)促進(jìn)神經(jīng)再生的初探,在對之后研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的同時也面臨著諸多問題,比如SME促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的分子生物學(xué)機(jī)制,對神經(jīng)元內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的干預(yù)等,都需要更深入的研究。

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