孫寶勝,張 矛,劉林林,孫 晶,侯吉光

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院放療三科,吉林長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤生物治療科;3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科;4.吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科)

人參皂苷Rg3是從人參中提取的有效單體成分。研究證明,人參皂苷Rg3可通過抑制腫瘤血管形成,阻斷腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[1,2];提高腫瘤病人免疫力,抑制轉(zhuǎn)移,并降低腫瘤病人放、化療后毒副作用[3]。本文通過觀察人參皂苷Rg3對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的存活率及細(xì)胞凋亡的變化,為其臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸鹽緩沖液均購(gòu)自 Invitrogen公司(Paisley,Scotland,UK)。Taurolidine(Taurolin)溶劑由Geistlich Pharm AG(Wolhusen,Switzerland)贈(zèng)送。其他的化學(xué)試劑均購(gòu)于sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

小鼠黑色瘤細(xì)胞(B16-4A5)購(gòu)于美國(guó)細(xì)胞庫(kù)(Manassas,VA)。B16-4A細(xì)胞均在含有10%小牛血清、青霉素(100 U·ml-1)和谷氨酰胺(2 mmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),并在37℃、5%CO2孵箱中貼壁生長(zhǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖活性測(cè)定

待B16-4A5細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期,調(diào)細(xì)胞濃度為1×105·ml-1。將B16-4A5細(xì)胞種植在 96孔培養(yǎng)板(100 μ l·well-1)24 h 后 ,分別給予不同濃度的 taurolidine,并確定最終濃度分別為 0、10、25、50、100 和200 μ mol·L-1。5%的 PVP作為空白對(duì)照組。B16-4A5細(xì)胞在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)24和48h后,給予100 μ l MTT(5.0g·L-1),37℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h,終止培養(yǎng) ,吸去上清,每孔加入150 μ L二甲基亞砜,振蕩 10 min在酶聯(lián)免疫吸附儀上測(cè)量各孔光吸收值(CPM)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組CPM值/對(duì)照組CPM 值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

待B16-4A5細(xì)胞接近對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,常規(guī)消化細(xì)胞,制成2.5×105·mL-1細(xì)胞懸液,接種于 6孔培養(yǎng)板中。24 h后,實(shí)驗(yàn)組給予上述不同濃度的taurolidine。5%的PVP作為空白對(duì)照組。B16-4A5細(xì)胞在37℃,CO2孵箱中培養(yǎng)24和48 h后,將貼壁及懸浮的細(xì)胞離心,收集后震蕩、混勻,在碘化丙啶(PI)混合溶液中(50 mg·L-1PI,3.4 mmol·L-1sodium citrate,1.0 mmol·L-1Tris,0.1 mmol·L-1EDTA,0.1%Triton X-100),并在4℃環(huán)境中避光培養(yǎng)4-6 h。流式細(xì)胞儀(BD biosciences,Mountain View,CA)進(jìn)行檢測(cè),Cell Guest軟件(BD Biosciences)收集并分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3對(duì)B16-4A5細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

表1是不同濃度人參皂苷Rg3分別作用于B16-4A5細(xì)胞24和48 h后,對(duì) B16-4A5細(xì)胞增殖能力的影響。從表1可見,人參皂苷Rg3抑制B16-4A5細(xì)胞生長(zhǎng)是隨時(shí)間和劑量而改變的,具有明顯的時(shí)效和量效的關(guān)系。

表1 不同劑量Rg3對(duì)B16-4A5細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

表2 不同劑量Rg3對(duì)B16-4A5細(xì)胞凋亡的影響

2.2 人參皂苷Rg3對(duì)B16-4A5細(xì)胞凋亡的影響

表2是不同濃度人參皂苷Rg3分別作用于B16-4A5細(xì)胞24和48 h后凋亡的影響。對(duì)照組的B16-4A5細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后,僅僅產(chǎn)生了小于5%的細(xì)胞凋亡;然而,細(xì)胞經(jīng)過50μ mol·L-1的人參皂苷Rg3作用后,能夠誘導(dǎo)15%的細(xì)胞凋亡,并顯示了明顯的時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)(表2)。

3 討論

黑色素瘤作為皮膚癌的一種,其發(fā)病率一直在世界范圍內(nèi)居高不下[5,6]。由于惡性黑色素瘤細(xì)胞很難被化學(xué)藥物及輻射誘導(dǎo)凋亡,所以對(duì)這些傳統(tǒng)的治療手段具有明顯的抗性。

劉基[4]等研究表明,人參皂苷Rg3對(duì)小鼠Lewis肺癌有抑瘤作用,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相符。結(jié)果顯示,人參皂苷Rg3具有明顯的誘導(dǎo)B16-4A5細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的特性,并且顯示了明顯的時(shí)間與量效的依賴關(guān)系。

[1]趙 翌.20(R)-人參Rg3抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué),2001,6(1):81.

[2]明 月,朱玉琢,拱中華,等.人參二醇組皂甙對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的抑制作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào),2003,2(29):149.

[3]胡笑克,吳利華,胡祖光.薏苡仁酯對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的放射增敏作用[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,12(5):234.

[4]劉 基,孫亮新,趙 翌,等.參一膠囊對(duì)乳腺癌化療患者免疫扶正Ⅱ期臨床研究[J].中國(guó)腫瘤臨床,2000,27:534.

[5]于勇華,陳延條,于金明,等.馬藺子素在食管癌放療中增敏作用的臨床研究[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,1999,19(5):313.

[6]曹棄元,李永強(qiáng),陳成欣,等.復(fù)方丹參、地龍、野木瓜對(duì)體外培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞的放射增敏作用[J].癌癥,1998,12(2):131.