張 英,陳 鵬,鄭利民

(1.北京大學深圳醫(yī)院麻醉科,廣東 深圳518036;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 麻醉科,吉林 長春130033)

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是傳遞絲裂原信號的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。在對學習記憶相關(guān)的行為學實驗以及LTP的誘導(dǎo)和維持的研究中發(fā)現(xiàn),應(yīng)用阻滯劑抑制ERK1/2的激活后,海馬LTP的誘發(fā)被抑制[1],小鼠水迷宮空間學習記憶能力[2,3]和大鼠條件性恐懼的學習記憶能力[4,5]均被削弱,因此,ERK1/2信號通路的激活與LTP和學習記憶功能密切相關(guān)。進一步的研究表明,ERK1/ERK2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活參與了短時記憶形成和短時記憶向長時記憶的轉(zhuǎn)化即記憶的鞏固過程[6,7]。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是轉(zhuǎn)錄/翻譯因子家族的一員,其磷酸化水平的增加參與了長時程增強(LTP)的維持和長時記憶形成[7,8]。丙泊酚(2,6-二異丙酚)是一種高效能的經(jīng)典靜脈麻醉劑,在臨床上廣泛用于全身麻醉誘導(dǎo)、維持和局部麻醉及重癥監(jiān)護病房患者的鎮(zhèn)靜。與其他靜脈麻醉劑一樣,除了鎮(zhèn)靜、催眠和麻醉作用外,丙泊酚還具有遺忘作用[9-11]。其明確的順行性遺忘作用有助于避免和減少恐懼記憶的獲得和存儲,從而可以減少患者圍手術(shù)期精神創(chuàng)傷和術(shù)后認知功能障礙的發(fā)生機率,其機制是否與ERK1/ERK2和CREB的磷酸化水平有關(guān)尚未定論。本研究擬評價丙泊酚對大鼠海馬ERK1/ERK2和CREB的磷酸化的影響,探討丙泊酚順行性遺忘作用的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 丙泊酚(10 mg/ml,批號:GF045,AstraZeneca S.p.A公司,意大利)。磷酸化ERK1/ERK2(p-ERK1/ERK2)多克隆兔抗體、ERK1/ERK2多克隆兔抗體和磷酸化CREB(p-CREB)多克隆兔抗體及CREB多克隆兔抗體(一抗,Cell Signaling,美國),β-actin多克隆兔抗體(一抗,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG抗體(二抗,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),ECL化學發(fā)光試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),Alpha ImagerTM2200圖像分析處理系統(tǒng)(Alpha Innotech公司,美國),考馬斯亮藍G-250(上?；瘜W試劑公司),其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純,用雙蒸水配制,調(diào)pH值至7.4。DBA-2大鼠避暗程序自動控制儀(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)。

1.2 動物選擇與分組 健康成年雄性SD大鼠80只,體重250-300 g,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。實驗前適應(yīng)環(huán)境1周,室溫22℃-25℃,明暗周期12 h/12 h,濕度50%-60%,自由飲食。隨機分為2組(n=40),對照組和咪達唑侖組。咪達唑侖組于訓練前15 min腹腔注射咪達唑侖3 mg/kg,容量為2 ml/kg,對照組注射等容量生理鹽水。

1.3 認知功能的測試 采用避暗箱實驗測試大鼠認知功能。將避暗箱鏈接DBA-2避暗程序自動控制儀。該儀器分明暗兩室,明室為透明的樹脂材料,明室上方10 cm固定一25 W鎢絲燈照明,暗室為黑色不透明的樹脂材料,明暗兩室中間有一直徑6 cm的圓形滑門。明暗兩室底部為直徑6 mm的銅柵,暗室箱底交流電壓為36 V,電流為1.5 mA。首先對大鼠進行訓練,將其置于明室背對滑門,60 s之后將門打開,當大鼠進入暗室后(即大鼠的四肢全部進入暗室)給予其足部電擊使其逃回明室,直至大鼠不再鉆入暗室,記錄100 s內(nèi)大鼠不再鉆入暗室所需的訓練次數(shù),在明室停留時間超過100 s認為大鼠對電擊刺激形成了記憶。于訓練結(jié)束后1、3、24 h(T1-3)時測試其記憶能力,只給予燈光刺激,當大鼠進入暗室后不給予足部電擊刺激,記錄大鼠在明室停留的時間即記憶潛伏期,當大鼠在明室停留時間超過600 s認為其記憶保持牢固,沒有發(fā)生遺忘。

1.4 p-ERK1/ERK2和p-CREB表達的測定 各組于給藥后15 min(T0)和T1-3記憶能力測試結(jié)束后,各斷頭處死8只大鼠,冰皿上分離海馬,液氮凍存?zhèn)溆谩Ｈ龃娴暮ｑR組織,加入裂解液,冰上勻漿,超聲破碎,4℃下15 000 r/min離心15 min,取上清液,BCA法測定蛋白濃度。取50 μ g蛋白上樣,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,電泳條件:恒壓,積層膠60 V,分離膠100 V。電泳結(jié)束后進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件:硝酸纖維素膜(NC),恒流,電流100 mA,冰上轉(zhuǎn)膜4 h。印跡膜在含 5%脫脂奶粉的TTBS緩沖液中封閉1 h,TTBS漂洗3次,每次5 min,分別與 ERK1/ERK2及 p-ERK1/ERK2一抗(1∶1 000)、CREB 及p-CREB 一抗(1∶500)和β-actin一抗(1∶1 000)進行雜交反應(yīng),4℃過夜,TTBS漂洗 3次,每次5 min。再將NC膜與HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫下?lián)u床雜交反應(yīng)1 h,再用TTBS漂洗3次,每次5 min,加入 ECL試劑反應(yīng)1 min后,保鮮膜包裹,暗室進行X線膠片曝光、顯影和定影。X線底片曝光顯影所示條帶放入Alpha ImagerTM 2200圖像分析處理系統(tǒng),利用Alpha Ease 40軟件進行光密度掃描分析。以ERK1/ERK2和CREB吸光度值與β-actin吸光度值之比表示ERK1/ERK2和CREB的表達,以 p-ERK1/ERK2和 p-CREB吸光度值與ERK1/ERK2和CREB吸光度值之比表示p-ERK1/ERK2和p-CREB的表達。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析,正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組內(nèi)比較采用單因素方差分析,組間比較采用成組t檢驗;偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q)]表示,組內(nèi)和組間比較采用秩和檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚組大鼠不再鉆入暗室所需的訓練次數(shù)3(1.25)較對照組1(0.25)增加(P＜0.01)。與T1時比較,生理鹽水組其它時點記憶潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),丙泊酚組其它時點記憶潛伏期縮短(P＜0.01);與生理鹽水組比較,丙泊酚組T2,3時記憶潛伏期縮短(P＜0.01),見表1。

2.2 兩組大鼠各個時點海馬ERK1、ERK2和CREB的表達均無差異(P＜0.05),見表2。

表1 兩組大鼠訓練結(jié)束后各時點記憶潛伏期的比較[s,n=8,M(Q)]

2.3 與T0時比較,生理鹽水組T1-3時p-ERK1,p-ERK2和p-CREB表達上調(diào),丙泊酚組T1,2時p-ERK1表達上調(diào),T3時p-ERK1表達下調(diào),T1-3時p-ERK2水平上調(diào),T2時p-CREB水平上調(diào);與生理鹽水組比較,丙泊酚組T2,3時p-ERK1表達下調(diào),T0-3時 p-ERK2和p-CREB表達下調(diào)(P＜0.01),見表3。

表2 兩組大鼠各時點海馬ERK1、ERK2和CREB表達的比較(n=8,±s)

表2 兩組大鼠各時點海馬ERK1、ERK2和CREB表達的比較(n=8,±s)

指標 組別 T0 T1 T2 T3 ERK1 group S 0.87±0.08 0.86±0.06 0.87±0.09 0.88±0.10 group P 0.86±0.11 0.84±0.11 0.85±0.08 0.89±0.07 ERK2 group S 0.97±0.09 1.00±0.06 0.99±0.10 1.04±0.09 group P 0.97±0.09 0.99±0.12 1.03±0.03 1.04±0.10 CREB group S 1.01±0.08 1.02±0.10 1.01±0.11 1.02±0.10 group P 1.04±0.10 1.03±0.14 0.99±0.08 1.02±0.12

表3 兩組大鼠各時點海馬 p-ERK1、p-ERK2和p-CREB表達的比較(n=8,±s)

表3 兩組大鼠各時點海馬 p-ERK1、p-ERK2和p-CREB表達的比較(n=8,±s)

與生理鹽水組比較,*P＜0.01;與T0時比較,#P＜0.05

指標 組別 T0 T1 T2 T3 p-ERK1/ERK1 group S 0.63±0.06 0.77±0.05# 0.78±0.08# 0.83±0.07#group P 0.54±0.10 0.77±0.05# 0.63±0.04*# 0.45±0.04*#p-ERK2/ERK2 group S 1.29±0.12 2.99±0.17# 2.99±0.39# 2.21±0.15#group P 0.90±0.07* 1.28±0.17*# 1.21±0.10*# 1.01±0.08*#p-CREB/CREB group S 0.89±0.06 1.74±0.12# 1.97±0.19# 1.59±0.14#group P 0.33±0.06* 0.31±0.07* 0.51±0.06*# 0.30±0.04*

3 討論

本研究采用大鼠連續(xù)多次明暗被動回避性條件反射實驗,觀察丙泊酚對條件性恐懼記憶獲得和存儲的影響,該法簡單易行,對記憶過程,特別是對傷害性刺激所產(chǎn)生的恐懼記憶的再現(xiàn)有較高的敏感性[12]。研究表明,丙泊酚的遺忘作用與其鎮(zhèn)靜作用關(guān)系并不密切[13,14],大鼠在小劑量(9-25 mg/kg)條件下主要影響記憶功能表現(xiàn)為比較明確的遺忘作用,不影響運動能力和情感,因此本研究選擇丙泊酚的劑量為9 mg/kg,結(jié)果表明,與生理鹽水組比較,丙泊酚組不再鉆入暗室所需的訓練次數(shù)增加,T2,3時記憶潛伏期縮短,且都小于600 s,提示訓練前腹腔注射丙泊酚9 mg/kg破壞了大鼠被動回避恐懼條件的學習能力,縮短了恐懼記憶的存儲時間,產(chǎn)生順行性遺忘,與以往的文獻結(jié)果基本一致[9]。本研究結(jié)果還表明,丙泊酚在訓練結(jié)束1 h后產(chǎn)生順行性遺忘,進一步說明了丙泊酚對短時記憶的形成沒有影響,但抑制了短時記憶向長時記憶的轉(zhuǎn)化,即記憶的鞏固過程。

本研究結(jié)果表明,與T0時比較,生理鹽水組T1-3時 ERK1、ERK2和CREB磷酸化水平均升高,ERK1磷酸化水平持續(xù)升高至T3時達峰值,ERK2磷酸化水平在T1,2時達峰值,CREB磷酸化水平于T2時達峰值,這一結(jié)果與文獻報道的ERK1、ERK2和CREB在學習記憶行為中的變化基本一致[15],也進一步說明了ERK1、ERK2和CREB參與了長時記憶的形成。ERK1/ERK2通過蘇氨酸和酪氨酸磷酸化后被激活,ERK1/ERK2被激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位可直接激活轉(zhuǎn)錄因子 Elk-1,后者作用于血清反應(yīng)元件(SRE),并作為許多即刻早期基因(IEG)的上游DNA序列,啟動IEG的轉(zhuǎn)錄;ERK1/ERK2也可通過激活核糖體S6激酶(Rsk)來激活轉(zhuǎn)錄因子CREB,從而作用于cAMP反應(yīng)元件(CRE),啟動CRE依賴性的轉(zhuǎn)錄。此外,ERK1/ERK2也可直接磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB[7]?？梢?ERK1/ERK2磷酸化水平升高后可易化其下游的轉(zhuǎn)錄翻譯,調(diào)節(jié)突觸蛋白的分布和功能,在突觸可塑性及記憶形成中發(fā)揮重要作用[7,16]。

研究表明,丙泊酚的鎮(zhèn)靜、催眠和遺忘作用與中樞GABA能神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和NMDA能神經(jīng)系統(tǒng)的抑制均相關(guān)[17-20]。研究也證實,丙泊酚對海馬長時程增強(Long-Term Potentiation,LTP)具有抑制作用[21],而且可能與抑制NMDA介導(dǎo)激活的細胞外信號傳導(dǎo)通路(ERK1/2)密切相關(guān)[18]。在LTP的誘導(dǎo)過程中,NMDA受體被激活后可激活ERK1/ERK2信號通路,使其下游的轉(zhuǎn)錄因子Elk、CREB被激活并進一步易化基因的表達[22]。本研究結(jié)果顯示,與生理鹽水組比較,丙泊酚組T2,3時p-ERK1表達下調(diào),T0-3時p-ERK2和p-CREB表達下調(diào),丙泊酚產(chǎn)生的順行性遺忘過程海馬ERK1/ERK2和CREB蛋白磷酸化水平僅短暫升高,提示丙泊酚對大鼠明暗被動回避訓練激活的海馬ERK1/ERK2和CREB蛋白磷酸化水平有抑制作用,這進一步證明丙泊酚遺忘作用與抑制ERK1/ERK2通路的激活進而抑制LTP的誘導(dǎo)和維持密切相關(guān)。我們在實驗前15 min腹腔注射9 mg/kg的丙泊酚,大鼠學習獲得能力有缺陷,但短時記憶的形成沒有受到影響,這與Trifilieff的研究一致[15]。Trifilieff于被動回避訓練前30 min海馬內(nèi)微量注射MEK的選擇性阻斷劑U0126,破壞了短時記憶的存儲,與對照組比較,海馬ERK1/ERK2和CREB蛋白無明顯的磷酸化水平升高過程,這一結(jié)果與我們在實驗中觀察到的丙泊酚的作用相似,提示丙泊酚可能通過阻斷ERK1/2激活后進一步級聯(lián)反應(yīng)激活CREB,從而抑制了短時記憶向長時記憶的轉(zhuǎn)化而發(fā)生遺忘。ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認為是細胞外多種刺激傳向細胞內(nèi)的交匯點,CREB是這些激酶級聯(lián)的下游靶位,因此,研究多證實阻斷ERK1/2活化的同時也會阻斷CREB蛋白的激活,但外界刺激引起Ca2+進入細胞后,與鈣調(diào)蛋白結(jié)合也可以通過激活Ca2+/CaM依賴蛋白磷酸化CREB[16],因此,咪達唑侖對大鼠明暗被動回避訓練激活的海馬CREB蛋白磷酸化的抑制作用也可能是與ERK1/2的活化無關(guān),而是直接抑制了CREB的磷酸化。

綜上所述,丙泊酚的順行性遺忘作用可能與抑制大鼠海馬ERK1、ERK2和CREB磷酸化水平相關(guān)。

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