吳金義,張 蕾*,張秀英,曲麗梅

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科,吉林長春130033;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科)

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種多功能細(xì)胞,它不僅是血液和組織間物質(zhì)交換的選擇性通透屏障,而且在造血調(diào)控、血管動(dòng)力學(xué)、血管生成、炎癥和免疫應(yīng)答等許多方面有十分重要的作用[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是通過合成和分泌多種生物活性皮物質(zhì),參與機(jī)體多種病理生理過程,并成為動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病、炎癥等的靶點(diǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或激活產(chǎn)生機(jī)能障礙可表現(xiàn)為血管收縮、血壓增高、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化及管腔狹窄、閉塞等。因此,成功分離和培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞,為心腦血管等疾病的研究提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)參考Jaffe法,并進(jìn)行改進(jìn),建立HUVEC體外分離原代培養(yǎng)的方法,并總結(jié)對培養(yǎng)的細(xì)胞鑒定方法,為多學(xué)科多種疾病病理生理機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 臍帶:吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科;0.25%胰蛋白酶(Difco);血清(武漢大學(xué))M199培養(yǎng)基(GIBCO);IMDM培養(yǎng)基(GIBCO);鼠抗人VIII因子單克隆抗體(Santa Cruz);辣根酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HUVECs分離、培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)參考Jaffe法,并進(jìn)行改進(jìn),應(yīng)用胰蛋白酶灌注臍靜脈收集內(nèi)皮細(xì)胞.在無菌條件下于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生兒臍帶,擠出臍帶血管中的血液,放入裝有含青鏈霉素的PBS液瓶中,2 h之內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)。在無菌條件下取新生兒臍帶,剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分,找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結(jié)扎固定,經(jīng)膠管接注射器,用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內(nèi)的殘血除凈后,用37℃PBS(0.01 molL,pH7.6),沖洗兩次,將另一端用鐵夾夾閉,向臍靜脈內(nèi)灌注0.25%胰蛋白酶(Difco)8-10 ml,夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12 min,在此期間經(jīng)常翻動(dòng)臍帶使酶溶液在血管內(nèi)流動(dòng)以促使內(nèi)皮細(xì)胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁,將含有內(nèi)皮細(xì)胞的胰蛋白酶注入50 ml錐形離心管中,加入小牛血清2 ml終止酶反應(yīng)。再以30 ml PBS沖洗管腔,流出液一并入離心管,1 000 r/min離心10 min,棄上清,加入含有10%小牛血清的IMDM(Gibco)培養(yǎng)液,充分混合制成細(xì)胞懸液。取0.1ml細(xì)胞懸液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。最后調(diào)細(xì)胞數(shù),以1×105/ml接種至24孔培養(yǎng)板中,每孔1ml。置于 5%CO2,37℃靜止培養(yǎng)24 h更換培養(yǎng)液,以除去未貼壁的細(xì)胞。以后每隔2 d換液1次,以維持細(xì)胞的營養(yǎng)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

1.2.2 HUVECs傳代 原代內(nèi)皮細(xì)胞融合后用培養(yǎng)液沖洗兩次,然后用0.25%胰酶和0.25%ETDA1∶1充分混勻后加入到內(nèi)皮細(xì)胞中,每孔0.3 ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細(xì)胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)液,吸管吹打,制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后按105個(gè)細(xì)胞/ml,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 培養(yǎng)HUVECs的三種方法鑒定 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Olympus倒置顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)及生長情況進(jìn)行觀察;透射電鏡下觀察培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞第VIII因子相關(guān)抗原的SP免疫組織化學(xué)染色法檢測相關(guān)抗原。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)過程中用Olympus倒置顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)及生長情況進(jìn)行觀察(如圖1)。早期細(xì)胞呈小多角、球形、呈團(tuán)狀,少數(shù)細(xì)胞伸展,24 h后可見細(xì)胞貼壁,48-72 h生長最快,逐漸生長成梭形,有些細(xì)胞排列呈魚貫狀相連,間有旋禍狀排列。核清晰,呈圓形或橢圓形,核分裂相多見,1-2核仁,胞漿豐富。于3-4 d后融合,7-10 d胞體呈多角形,相互嵌合,為單層呈鋪路石狀排列。

圖1 HUVECs形態(tài)觀察:單層鋪路石樣排列

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察

透射電鏡下觀察培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞,可見細(xì)胞呈多角形,表面有胞漿突起形成的細(xì)絨毛。有較多的胞漿空泡,有豐富的線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及溶酶體。胞漿內(nèi)還有作用為人內(nèi)皮細(xì)胞特征性標(biāo)志的Weibel-Palade小體(W-P小體),其橫切面呈圓形或橢圓形,縱切面呈桿狀,均可見小管狀結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 HUVECs超微結(jié)構(gòu),典型 Weibel-Palade小體

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞中人第VIII因子相關(guān)抗原的檢測[2]

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞第VIII因子相關(guān)抗原的SP免疫組織化學(xué)染色法可見細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形,胞漿豐富,并有棕黃色的染色顆粒,即為陽性反應(yīng),證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。對照組細(xì)胞為陰性結(jié)果 。(圖 3)

2.4 HUVECs各階段生長狀況(圖4-6)

圖3 FⅧAg強(qiáng)陽性

圖4 第2天臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

3 討論

圖5 第4天臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

圖6 第7天臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

人臍靜脈作為培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的來源,是因?yàn)樗哂腥〔?、操作方?技術(shù)較成熟,獲得細(xì)胞數(shù)多,為心腦血管疾病病理生理機(jī)制的研究提供了方便。在培養(yǎng)細(xì)胞的獲取方法上,有機(jī)械刮取、組織塊移植和酶消化法三種。機(jī)械刮取法即將臍靜脈沿縱軸剪開,用消毒手術(shù)刀背等刮取ECs,發(fā)現(xiàn)這一種方法不是因?yàn)楣蔚锰p取得的細(xì)胞數(shù)太少,就是過度刮取導(dǎo)致含有較多其它非內(nèi)皮細(xì)胞成分,需進(jìn)一步純化,或損傷細(xì)胞,導(dǎo)致存活率不高。灌注消化法因?yàn)橄瘯r(shí)間難于掌握,不是因?yàn)橄瘯r(shí)間過短取得的細(xì)胞數(shù)太少,就是消化過度致使細(xì)胞存活率低,因此,這兩種方法均難于獲得滿意效果[3]?，F(xiàn)在大多數(shù)學(xué)者在研究中應(yīng)用胰蛋白酶灌注臍靜脈收集內(nèi)皮細(xì)胞,接種后很快貼壁生長。我們經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)比較,以0.25%的胰酶、作用8 min及溫度為37℃為最佳條件。如果溫度過高,時(shí)間過長都會(huì)增加纖維母細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞脫落混入內(nèi)皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞成活率低。取材要新鮮,保存時(shí)間以6 h之內(nèi)為好,超過6 h時(shí)間會(huì)使細(xì)胞存活率降低。有研究表明[4]人臍帶靜脈離體后,隨著時(shí)間的延長,內(nèi)皮細(xì)胞某些物質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生變化,離體超過6 h,內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原釋放量以及前列環(huán)素生成量均隨放置時(shí)間延長而呈下降超勢,變化顯著,且臍帶離體時(shí)間與細(xì)胞成活率是負(fù)相關(guān)。培養(yǎng)液的pH值是影響細(xì)胞生長的因素之一,內(nèi)皮細(xì)胞生長的最適pH值為7.2-7.4,初期培養(yǎng)液的pH值宜稍低(pH7.0左右),這樣細(xì)胞易貼壁和生長。培養(yǎng)液中需加一定濃度的血清。原因可能是血液在凝固過程中血小板聚集時(shí)所釋放的各種因子有刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用,尤其是血小板能夠釋放一種血小板衍生因子,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長繁殖。血清的質(zhì)量也很重要,培養(yǎng)液用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),必須附加一定量的血清,否則細(xì)胞貼壁伸展能力較弱,貼壁細(xì)胞繁殖速度慢,且以后多懸浮、死亡,我們的經(jīng)驗(yàn)是進(jìn)口胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞成長好,成功率高。關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定,WebelER等在1964年研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞漿中有桿狀多管小體,Jaffe和Gimbrene等提出內(nèi)皮細(xì)胞鑒定法的根據(jù)是:①相差顯微鏡下,細(xì)胞呈多角形,單層鋪路石狀排列,或短梭形細(xì)胞呈魚貫樣排列。②熒光抗體法證明胞漿中有VWF因子。③透射電鏡下,胞漿內(nèi)有Weibel-palade小體。結(jié)果符合上述鑒定標(biāo)準(zhǔn),可確定為內(nèi)皮細(xì)胞。Jaffe[5]進(jìn)一步研究認(rèn)為VWF相關(guān)抗原免疫熒光檢測最為可靠,因?yàn)樵谌梭w內(nèi),除內(nèi)皮細(xì)胞外,僅在血小板和巨核細(xì)胞中存在因子VWF相關(guān)抗原,故可與血管平滑肌和成纖維細(xì)胞相鑒別。至于Weibel-palabe小體在胞漿中檢出,固然對內(nèi)皮細(xì)胞鑒定具有特異性,但并非每個(gè)細(xì)胞皆能檢出,故意義不大?？傊?我們綜合了上述多個(gè)學(xué)者的經(jīng)驗(yàn)成功培養(yǎng)出臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行多個(gè)鑒定方法的嘗試,為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｗ钚卵芯堪l(fā)現(xiàn)[6],血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子等有助于培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞,胚胎干細(xì)胞有望成為新的種子細(xì)胞來源。

[1]Oruckaptan HH,Senmevsim O,Ozcan OE,et al.Pituitary adenomas results of 684 surgically treated patients and review of the literature[J].Surg Neurol,2000,53(3):211.

[2]李孟彬,王為忠,張宏偉,等.豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與表型鑒定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(24):45.

[3]Gomez DE,Alonso DF,Yoshiji H,etal.Tissue inhibitors of metal-proteinases structure,regulation and biological functions[J].Eur J Cell Boil,1997,74:111.

[4]王建民,劉萌秋,賴西南.正常臍靜脈離體后不同時(shí)間內(nèi)某些物質(zhì)含量的變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,17:86.

[5]Jaffe EA.Synthesis of antibemophilic factor antigen by cultured humanendothelialcells[J].J Clin Invest,1973,52:2757.

[6]Savore C,Zhang C,MuirC,et al.Perlecan Knockdown inmetastatic prostate cancer cells reduces heparin-binding growth factor responses in vitro and tumor growth in vivo[J].Clin ExpMetastasis,2005,22(5):377.