朱 超,蘇冠方

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科,吉林長春130041)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最為常見和嚴重的微血管并發(fā)癥之一,也是目前發(fā)達國家成人致盲的主要原因。糖尿病患者的長期高血糖狀態(tài)與DR的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。在高血糖情況下,葡萄糖被氧化成醛糖后,能夠造成視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞的損傷,影響視網(wǎng)膜外屏障功能。但是高糖引起RPE細胞損傷的機制尚不十分清楚。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一種強有力的抗氧化劑,其自身具有自由基清除功能,并且在進入細胞后去乙?；砂腚装彼?能促進谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成,后者是細胞對抗氧化應(yīng)激損傷的主要力量。我們將觀察NAC是否能夠通過其自身的抗氧化特性對抗葡萄糖/葡萄糖氧化酶(Glucose/Glucose oxidase,G/GO)造成的RPE細胞的損傷而發(fā)揮其保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網(wǎng)膜色素上皮(human Retinal pigment epithelium,hRPE)細胞株D407購自中山大學(xué)動物實驗中心細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司。標準胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司。MTT、DHR購自Sigma公司。GO購自Amresco公司。NAC購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。iNOS單克隆抗體購自美國Upstate公司;ECL化學(xué)發(fā)光底物購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 細胞在含10%胎牛血清的低糖(5.5 mM葡萄糖)DMEM培養(yǎng)液中,于37℃、體積分數(shù)95%空氣、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取傳至第6代的RPE細胞接種于96孔或6孔板,待細胞長至40%-50%時,傾去培養(yǎng)液,PBS洗2遍后分成4組,即低糖組:用含5.5 mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液;高糖組:用含33 mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液;對照組:用低糖+15 mU GO的DMEM培養(yǎng)液;G/GO組:用高糖+不同濃度GO的DMEM培養(yǎng)液;+NAC組:G/GO組+NAC的DMEM培養(yǎng)液;以上各組均置于常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期細胞,以5×105cells/well的濃度100 μ l接種于 96孔培養(yǎng)板。每組6個孔,經(jīng)藥物處理6 h后,每孔加5g/L MTT20 μ l,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,傾去培養(yǎng)液 ,每孔加 150μ l DMSO,室溫振蕩 10 min后,用酶標儀(TECAN-GENious,Switzerland)在570 nm波長處記錄吸光度值(OD值)。取10孔OD值的均數(shù)按公式計算細胞存活率,即細胞存活率(%)=處理組OD值/對照組OD值 ×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細胞內(nèi)ROS水平的測定 hRPE細胞分組處理4 h,傾去培養(yǎng)基,用無血清培養(yǎng)基洗2次,收集細胞,用含 1 μ M DHR的無血清培養(yǎng)基制成3×105cells/L的細胞懸液,流式細胞儀(FACS Calibur,Becton Dickinson)檢測(激發(fā):488 nm;發(fā)射波長:525 nm),每個樣品測定10 000個活細胞,直方圖下面積代表Rh123的平均熒光強度(mean flourscence indensity,MFI),不同處理因素作用下的ROS水平以MFI表示。

1.2.4 Western免疫印跡法檢測iNOS蛋白的表達

各組細胞提取總蛋白,定量后,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,再將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,進行抗原-抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)。計算iNOS/β-actin灰度比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 G/GO對RPE細胞存活率的影響

10 mU、15 mU和20 mU GO作用于hRPE細胞6 h后,hRPE細胞的存活率分別減少為81.4%±8.7%、69.2%±8.2%、32.5%±7.5%,均 P ＜0.05。GO 5-20 mU的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性地抑制hRPE細胞的存活率(圖1)。

圖1 不同濃度的GO對hRPE細胞存活率的影響

2.2 NAC拮抗G/GO對RPE細胞存活率的抑制作用

2.5 mM、5 mM NAC對hRPE細胞存活率無明顯影響,但是能夠減輕10 mU和15 mU GO的細胞毒性,使hRPE細胞存活率顯著地提高(P＜0.05)(圖2)。

圖2 NAC對G/G O抑制hRPE細胞存活率的影響

2.3 NAC抑制G/GO誘導(dǎo)的RPE細胞釋放ROS

15 mUGO處理hRPE細胞4 h后,胞內(nèi)MFI較對照組明顯地增強(P＜0.05),在應(yīng)用15mU GO和2.5 mM、5 mM NAC作用于hRPE細胞能使MFI較G/GO時明顯降低(P＜0.05)(圖3)。結(jié)果表明,NAC可顯著地抑制G/GO引起的hRPE細胞內(nèi)ROS的堆積。

2.4 NAC抑制G/GO誘導(dǎo)的RPE細胞iNOS表達

正常對照組iNOS的表達很低(灰度值為0.19);G/GO組明顯刺激iNOS表達(灰度值為0.89),與對照組相比,iNOS蛋白表達量明顯增加(P＜0.05);同時加入2.5 mM、5 mM NAC處理后,iNOS的條帶明顯變淺(灰度值為0.52,0.27),與G/GO組相比,iN-OS蛋白表達量明顯降低(P＜0.05)(圖4)。

圖3 NAC對G/G O增加hRPE細胞內(nèi)ROS水平的影響

圖4 NAC對G/G O增加hRPE細胞iNOS表達的影響

3 討論

DR早期RPE細胞出現(xiàn)異常熒光素滲漏,其滲透性增加并伴隨基底膜增厚等組織學(xué)的改變。視覺電生理研究也表明RPE細胞的改變要早于糖尿病視網(wǎng)膜血管內(nèi)病變的發(fā)生。但是,RPE細胞在DR早期發(fā)生改變的機制尚不清楚。

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)能夠刺激產(chǎn)生大量的NO,NO與增多的O2-可快速反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite,ONOO-)。ONOO-及其衍生物的氧化能力比H2O2大2000倍,是目前已知氧化作用最強的一類物質(zhì),可選擇性的使蛋白質(zhì)中的酪氨酸發(fā)生硝基化,生成3-硝基酪氨酸,對生物膜、蛋白酶、DNA造成氧化損傷,影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。有資料表明高糖促使RPE細胞iNOS表達增加,從而生成過量的NO,造成細胞損傷[1]。

一直以來,如何保護RPE細胞免受高血糖的損傷繼而延緩DR發(fā)生發(fā)展的問題備受學(xué)者們的關(guān)注。NAC是一種強有力的抗氧化劑,能促進GSH的合成。GSH是細胞對抗氧化應(yīng)激損傷的主要力量。正常情況下RPE細胞通過合成GSH來清除自由基以保證感光細胞的正常功能。當(dāng)視網(wǎng)膜發(fā)生氧化損傷時,GSH被大量消耗。通過外源性補充GSH被證實是維持RPE細胞內(nèi)GSH含量較為有效的方法[2]。Tsai等人發(fā)現(xiàn)NAC對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的早期DR大鼠具有保護作用[3],NAC的自由基清除能力有效的減少了DR早期病變的發(fā)生。

高血糖情況下,葡萄糖被氧化成醛糖,從而產(chǎn)生相當(dāng)多的山梨醇,山梨醇在細胞內(nèi)聚集,產(chǎn)生高滲作用,導(dǎo)致細胞損傷[4]。本實驗?zāi)M高糖環(huán)境,應(yīng)用GO能夠在體外催化葡萄糖發(fā)生自身氧化的原理而建立氧化損傷細胞的模型。我們采用含G/GO的DMEM培養(yǎng)液處理hRPE細胞6 h,MTT法檢測結(jié)果顯示,G/GO組細胞存活率明顯低于低糖對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明G/GO作用6 h已經(jīng)造成hRPE細胞損傷;而加入NAC處理后,細胞存活率比G/GO組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明NAC可以減輕細胞損傷,對細胞具有保護作用。GO在體外催化葡萄糖發(fā)生氧化并釋放ROS而氧化損傷了hRPE細胞,NAC通過自身抗氧化作用而減少了ROS的生成。此外,NAC還通過抑制iNOS來減少NO的生成,提示G/GO導(dǎo)致的hRPE細胞損傷可能與iNOS的激活及NO的大量產(chǎn)生有關(guān)。Western免疫印跡法結(jié)果顯示,在正常培養(yǎng)條件下,hRPE細胞中iNOS幾乎不表達;而在G/GO培養(yǎng)條件下,hRPE細胞中iNOS表達顯著升高,從而生成過量的NO,造成細胞損傷;而加入NAC處理后,hRPE細胞中iNOS表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,證實G/GO導(dǎo)致的hRPE細胞損傷可能與iNOS的激活及NO的大量產(chǎn)生有關(guān),而NAC保護損傷細胞。

綜上所述,我們推測NAC對抗G/GO對hRPE細胞的氧化應(yīng)激作用可能主要與其抑制NOS活性,減少NO生成,進而減輕細胞內(nèi)ROS的堆積有關(guān)。然而,有關(guān)NAC對hRPE保護作用的分子機制有待我們進行進一步的研究。

[1]Yuan Z,Feng W,Hong J,et al.p38MAPK and ERK promote nitric oxide production in cultured human retinal pigmented epithelial cells induced by high concentration glucose[J].Nitric Oxide,2009,20(1):9.

[2]Wefers H,Sies H.Hepatic low-level chemiluminescence during redox cycling of menadione and the menadione-glutathione conjugate:relation to glutathione and NAD(P)H:quinone reductase(DT-diaphorase)activity[J].Arch Biochem Biophys,1983,224(2):568.

[3]Tsai GY,Cui JZ,Syed H,et al.Effect of N-acetylcysteine on the early expression of inflammatory markers in the retina and plasma of diabetic rats[J].Clin Experiment Ophthalmol,2009,37(2):223.

[4]張承芬,張惠蓉.糖尿病的眼部并發(fā)癥及治療[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:132-133.