魏海峰,李 才,魏雁虹,劉 輝,孫 波,苗春生

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室,吉林長(zhǎng)春130021;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院;3.吉林省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

本研究擬觀察高糖及糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)環(huán)境對(duì)腎小球系膜細(xì)胞(GMC)的增殖能力和細(xì)胞培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原含量的變化,以及具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗氧化等功能的單寧酸對(duì)此作用的影響,探討延緩腎小球硬化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株,由吉林大學(xué)病理生理學(xué)教研室惠贈(zèng)。單寧酸(TA,Sigma),分子式C76H52O46,分子量1701。氨基胍(AG,Sigma),牛血清白蛋白(BSA,組分Ⅴ)。DMEM 培養(yǎng)基(Gibco),小牛血清(FBS,天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司),胰蛋白酶(Gibco),MTT(Sigma),兔抗大鼠Ⅳ型膠原(Santa Cruz),過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德)。CO2培養(yǎng)箱(SHEL-LAB),XSB-1A倒置生物顯微鏡,DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,RF-540型熒光分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AGEs的制備 將牛血清白蛋白(組分Ⅴ)10 mg/ml,葡萄糖 0.5 mol/L,EDTA 1 mmol/L,青霉素100 u/ml,鏈霉素 100 μ g/ml,溶于 pH 7.2 PBS,過(guò)濾除菌,37℃恒溫箱避光孵育2個(gè)月,透析除糖后制備糖化牛血清白蛋白(AGEs)。同樣條件下孵育不含葡萄糖的牛血清白蛋白(BSA)作為陰性對(duì)照,熒光分光光度計(jì)測(cè)定AGEs和BSA含量分別為28.7和4.3任意熒光單位。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠腎小球系膜細(xì)胞株接種于含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí),更換為含0.5%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞同步化。然后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(含5.6 mmol/L D-葡萄糖)、高糖組(含30 mmol/L D-葡萄糖)、甘露醇組(含25 mmol/L甘露醇)、AGEs及BSA組:將AGEs或 BSA加入低糖DMEM培養(yǎng)液中,使AGEs及BSA終濃度均為0、25、50、100、200、400 mg/L。藥物處理組:在高糖或AGEs處理的同時(shí)加入藥物,單寧酸分為10、20、40及80 μ mol/L四個(gè)濃度組,氨基胍(AG)作為陽(yáng)性對(duì)照藥 ,終濃度為 250 μ mmol/L 。

1.2.3 GMC增殖的檢測(cè) 將同步化的細(xì)胞密度調(diào)整至1×103個(gè)/孔,以 100 μ l/孔接種于 96孔培養(yǎng)板,按上述分組進(jìn)行處理,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間段(24、48 h)后取出細(xì)胞培養(yǎng)板,在倒置顯微鏡下觀察,每孔加入MTT溶液 20 μ l/孔,于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,加入DMSO液 150 μ l/孔,室溫下將96孔板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min。利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)GMC培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原的水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以2×104個(gè)/孔接種至24孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞貼壁后,無(wú)血清饑餓24 h,使同步化,然后加入各條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集培養(yǎng)上清,-20℃保存?zhèn)溆?。ELISA具體方法:將條件培養(yǎng)基和包被液按一定比例加入到96孔酶標(biāo)板中,100 μ l/孔,4℃過(guò)夜。吸出上清液,加入封閉液200 μ l/孔 ,37℃孵育 1.5 h。加入 100 μ l稀釋的第一抗體(1∶1000),37 ℃孵育2 h。加入100 μ l稀釋的第二抗體(1∶2000),37 ℃孵育1.5 h。加入100 μ l DAB顯色液,室溫避光3-5 min,終止液終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(A)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度單寧酸對(duì)高糖環(huán)境下GMC增殖和Ⅳ型膠原生成的影響

見(jiàn)表1。甘露醇組與對(duì)照組無(wú)明顯差別,數(shù)據(jù)未在下表列出。

表1 單寧酸對(duì)高糖環(huán)境下GMC增殖的影響和培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原的含量(±s,n=6)

表1 單寧酸對(duì)高糖環(huán)境下GMC增殖的影響和培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原的含量(±s,n=6)

注:與正常對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與高糖組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

正常對(duì)照組 0.195±0.037 0.255±0.063 0.076±0.018高糖組 0.307±0.054**0.435±0.088** 0.132±0.023**AG+高糖組 250 0.240±0.065△ 0.318±0.074△△ 0.099±0.020*△△TA+高糖組 10 0.261±0.045* 0.365±0.073* 0.118±0.024**20 0.255±0.053* 0.328±0.059△ 0.120±0.017**40 0.232±0.033△ 0.331±0.088△ 0.104±0.017*△80 0.222±0.053△△ 0.301±0.054△△ 0.086±0.015△△

2.2 不同濃度AGEs對(duì)GMC增殖和Ⅳ型膠原生成的影響

用AGEs(50-200 mg/L)處理后可明顯刺激GMC增殖和促進(jìn)細(xì)胞外Ⅳ型膠原生成,與相同濃度的BSA組比較,差異具有顯著性意義,見(jiàn)圖1、圖2。其中200 mg/L AGEs刺激細(xì)胞增殖和Ⅳ型膠原生成的作用均明顯(P＜0.01),400 mg/L AGEs刺激細(xì)胞增殖的作用有所降低,但仍可明顯促進(jìn)Ⅳ型膠原生成(P＜0.01)。因此,在下面研究中選用200 mg/L AGEs這一濃度。

2.3 不同濃度單寧酸對(duì)AGEs所致GMC增殖和Ⅳ型膠原生成的影響

與不含藥物的AGEs組比較,單寧酸(20、40、80 μ mol/L)可明顯抑制AGEs(200 mg/L)引起的GMC增殖,以 40 μ mol/L單寧酸的作用最為顯著(P＜0.01)。10 μ mol/L單寧酸即能明顯減少AGEs誘導(dǎo)Ⅳ型膠原的生成,20、40和 80 μ mol/L單寧酸能使Ⅳ型膠原生成進(jìn)一步降低,與BSA組比較無(wú)顯著差別,結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 不同濃度AGEs對(duì)GMC增殖的影響(±s,n=6)

圖2 不同濃度AGEs對(duì)Ⅳ型膠原生成的影響(±s,n=6)

表2 單寧酸對(duì)AGEs所致GMC增殖的影響和培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原的含量(±s,n=6)

表2 單寧酸對(duì)AGEs所致GMC增殖的影響和培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原的含量(±s,n=6)

注:與 BSA組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與 AGEs組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 濃度(μ mol/L)24 h MTT(A)48 h MTT(A)ColⅣ(A)BSA組 0.251±0.033 0.295±0.074 0.084±0.024 AGEs組 0.362±0.060**0.523±0.056** 0.193±0.038**AG+AGEs組 250 0.297±0.048△ 0.367±0.042△△ 0.137±0.041*△TA+AGEs組 10 0.322±0.055**0.452±0.103** 0.141±0.049*△TA+AGEs組 20 0.316±0.048* 0.405±0.099*△ 0.129±0.043△TA+AGEs組 40 0.288±0.031△△ 0.372±0.076△△ 0.124±0.058△△TA+AGEs組 80 0.306±0.022*△ 0.390±0.053△ 0.116±0.031△△

3 討論

在正常情況下,體外培養(yǎng)的GMC增殖能力和分泌ECM的能力很弱,在一定刺激因素的作用下GMC的生物學(xué)行為發(fā)生改變。有研究表明,10 mmol/L以上的高濃度葡萄糖可以促進(jìn)GMC增殖和膠原生成[1],其增殖效應(yīng)可能與各種生長(zhǎng)因子及炎癥因子的介導(dǎo)及一些信號(hào)通路的激活有關(guān)[2-4]。本研究選用30 mmol/L的葡萄糖作用于GMC,在24、48 h時(shí)間段觀察GMC的變化。研究結(jié)果顯示,同正常對(duì)照組相比,高糖誘導(dǎo)24h和48 h后,GMC增殖顯著增加,Ⅳ型膠原生成增多,甘露醇組細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化。本研究再次證明高糖可以促進(jìn)GMC的增殖以及ECM成分的積聚。

在持續(xù)高血糖狀態(tài)下,葡萄糖及其代謝產(chǎn)物與多種蛋白質(zhì)發(fā)生的非酶促糖基化反應(yīng)形成不可逆的AGEs,這種蛋白質(zhì)抑制ECM酶降解,使腎小球基底膜成分交聯(lián)增多,使蛋白更易透過(guò)濾過(guò)膜,濾過(guò)的白蛋白堆積在系膜區(qū)可促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖及導(dǎo)致ECM積聚。AGEs的積聚與DN的腎組織損傷、腎功能改變有密切關(guān)系。本研究檢測(cè)了不同濃度AGEs作用于GMC,發(fā)現(xiàn)AGEs可明顯刺激GMC的增殖和促進(jìn)細(xì)胞外Ⅳ型膠原的生成,并且基本上呈濃度依賴(lài)性。在無(wú)糖的情況下,AGEs可單獨(dú)引起GMC的病理改變,且與高糖的作用相似,提示AGEs的形成與高血糖在DN的發(fā)病中扮演同樣重要的角色。AGEs通過(guò)形成交聯(lián)與受體相互作用,誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子的釋放和ECM的產(chǎn)生及增加氧化應(yīng)激來(lái)發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng),因此,通過(guò)減少AGEs的生成或應(yīng)用特異性AGEs抑制劑、抗氧化劑阻止AGEs的不利作用可以緩解AGEs引起的組織或細(xì)胞損傷,延緩DN的發(fā)生發(fā)展。

單寧酸又稱(chēng)為鞣酸、鞣質(zhì),廣泛存在于植物界,約70%以上的中草藥及茶葉、某些食物中均含有此類(lèi)化合物。研究表明,單寧酸具有抗炎、抗氧化、降低血糖、血壓,調(diào)整脂代謝等多種作用[5,6]。Tikoo等[7]研究顯示,單寧酸可改善糖尿病大鼠的一般狀況及腎功能。本研究組應(yīng)用單寧酸治療糖尿病大鼠10周,電鏡下觀察治療組糖尿病大鼠腎臟腎小球基底膜增厚情況明顯減輕,系膜細(xì)胞及基質(zhì)未見(jiàn)明顯增多(另文發(fā)表)。本次體外實(shí)驗(yàn)觀察到單寧酸能明顯抑制高糖或AGEs引起的GMC增殖,減少Ⅳ型膠原的生成,并呈一定濃度依賴(lài)性,與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。我們推測(cè)單寧酸的這種作用可能是通過(guò)改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,抑制了細(xì)胞內(nèi)的非酶糖基化、氧化應(yīng)激、炎癥因子等的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。因此,深入研究單寧酸調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增殖和膠原生成的機(jī)制,可能為糖尿病腎病的防治提供有用的藥物。

[1]張 艷,關(guān)廣聚,陳 兵,等.酶酚酸酯對(duì)高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,44(7):718.

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