江漢秋,張曉君,劉 瑾,馬中華,賈建平

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100073;2.北京健宮醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100053;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,北京100053)

N-甲基-D-天冬氨酸受體2B(N-methyl-D-aspartate receptor 2B,NR2B)是 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體的重要亞基,其結(jié)構(gòu)中包含谷氨酸與NMDA受體結(jié)合的位點[1],被認(rèn)為是NMDA受體發(fā)揮藥理學(xué)、電生理學(xué)及行為學(xué)作用的主要亞基。在之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)中國北方漢族人群GRIN2B基因近似啟動子區(qū)共存在4個變異位 點,為分 別 為-200T/G(rs1019385)、-421C/A(rs3764028)、-1447T/C(ENS10557853)和-1497G/A(rs12368476),并通過對362例SAD患者和334例健康老年人的遺傳學(xué)分析得出,-421C/A多態(tài)性與AD發(fā)病有明顯的相關(guān)性。為此,本研究預(yù)從功能學(xué)角度進(jìn)一步探討GRIN2B啟動子區(qū)變異與SAD的發(fā)病關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建報告基因質(zhì)粒

1.1.1 基因重組 我們用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物,兩端分別加入KpnⅠ和NheⅠ識別序列及相應(yīng)保護(hù)堿基。引物序列為:

上游:5'-GGGGTACCAACTGCAAACCTGCCCGATA-3'

下游:5'-CTAGCTAGCACCCTTGACGAGCACTCTC-3'

其中GGTACC為KpnⅠ內(nèi)切酶的酶切序列,GCTAGC為NheⅠ內(nèi)切酶的酶切序列。

以本課題組之前研究證實含有-200T/-421C/-1447T/-1497G和-200G/-421A/-1447C/-1497A單體型的純合子基因組DNA為模板,進(jìn)行GRIN2B啟動子片段PCR擴增(共1798 bp)。反應(yīng)體系為:DDH2O 32.4 μ l,10 ×緩沖液 5.0 μ l,MgCl2(2 5mM)3.0 μ l,dNTP(10 mM)1.6 μ l,上 、下游引物(10 pmol/μ l)各 2.0 μ l,KOD Plus(1 U/μ l)2.0 μ l,模板 2.0 μ l;PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃30 s,68℃30 s,72℃2 min,共30循環(huán),72℃再延伸7 min。獲得的目的片段與pGL3-Basic質(zhì)粒用KpnⅠ和NheⅠ分別雙酶切,之后將全部的酶切產(chǎn)物按凝膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行DNA純化、回收。按連接試劑盒操作說明進(jìn)行載體DNA與插入DNA目的片段的連接。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α,后經(jīng)菌落PCR及對極可能的陽性克隆擴增得到的菌液進(jìn)行直接測序,鑒定得到的陽性克隆。按質(zhì)粒提取試劑盒操作說明進(jìn)行質(zhì)粒提取,最后經(jīng)雙酶切及直接測序法進(jìn)一步證實連接是否成功。

1.1.2 定點突變 由于我們需要對GRIN2B啟動子區(qū)-200T/-421A/-1447T/-1497G單體型進(jìn)行功能學(xué)研究,而在本實驗的樣本中,GRIN2B啟動子不存在這樣的純合型個體,故我們應(yīng)用QuickChange○R定點突變試劑盒經(jīng)過一步法進(jìn)行定點突變。定點突變所需引物為:

上游:5'-TTCCGTCCCCCTTCCATCC A CCTTACCACCCCACTTCC-3'

下游:5'-GGAAGTGGGGTGGTAAGG T GGATGGAAGGGGGACGG-3'

加框堿基為定點突變位點C→A,G→T。

PCR反應(yīng)體系為:DDH2O 36.4 μ l,10×緩沖液5.0 μ l,dNTP(2.5 mM)1.0 μ l,上 、下游引物(100 ng/μ l)各 1.8 μ l,野生質(zhì)粒(10 ng/μ l)4.0 μ l,pfuTurbo 酶(2.5 U/μ l)1.0 μ l。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 30 s,95℃30 s,55℃1 min,68℃8 min,共18個循環(huán)。向擴增后的PCR 產(chǎn)物中直接加1 μ l(10 U/μ l)DpnⅠ用于消化甲基化的野生型質(zhì)粒。最后進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌、菌落PCR、測序及質(zhì)粒提取等,得到突變質(zhì)粒。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及報告基因檢測

SH-SY5Y和HeLa細(xì)胞分別用含有10%和5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(已加入200 IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長狀態(tài)良好后,SH-SY5Y和HeLa細(xì)胞分別以4×104個/孔和1×104個/孔的密度鋪96孔板,100 μ l/孔。細(xì)胞在96孔板生長24 h后,按照操作說明書用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Lipo2000)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在此過程中,pGL3-Basic質(zhì)粒作陰性對照,pGL3-Control質(zhì)粒作陽性對照。當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)48 h后,按照說明書操作,進(jìn)行裂解細(xì)胞,用GloMaxTM96微孔熒光分析儀檢測螢火蟲熒光素酶活性(luciferase activity of firefly,LAF)及海腎熒光素酶活性(luciferase activity of renilla,LAR),并自動計算出RLA,記錄所有數(shù)據(jù)。每次每種質(zhì)粒至少鋪孔6個,相同實驗重復(fù)至少3次。

1.3 細(xì)胞干預(yù)

當(dāng)細(xì)胞同前進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h后,將Na2S2O41 mM、H2O225 μ M 和 Aβ25-3515 μ M 最終工作濃度分別加入相應(yīng)細(xì)胞孔中,剝奪血清則是用無血清DMEM培養(yǎng)基替換正常DMEM培養(yǎng)基。待各種干預(yù)因素作用24 h后,裂解細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測并計算RLA(同前)。同樣每種質(zhì)粒相同條件下每次鋪孔至少6個,相同實驗重復(fù)至少3次。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 報告基因質(zhì)粒的建立

利用基因重組和定點突變技術(shù),我們成功構(gòu)建了三種GRIN2B啟動子報告基因質(zhì)粒,分別為pGLTCTG(-200T/-421C/-1447T/-1497G)、pGL-TATG(-200T/-421A/-1447T/-1497G)和pGL-GACA(-200G/-421A/-1447C/-1497A)。

以pGL-TCTG為例,我們通過兩端分別加有KpnⅠ和NheⅠ的引物擴增出基因型為-200T/-421C/-1447T/-1497G的GRIN2B啟動子連接片段。經(jīng)基因重組技術(shù),擴增、提取出野生質(zhì)粒。其中,菌落PCR電泳結(jié)果可初步證實極可能連接成功的陽性克隆(圖1);雙酶切進(jìn)一步證實、鑒定陽性克隆(圖2);最后經(jīng)測序證實成功構(gòu)建了pGL-TCTG質(zhì)粒。

圖1 菌落PCR電泳圖

圖2 陽性克隆雙酶切電泳圖

我們以pGL-TCTG為模板,經(jīng)一步法PCR擴增突變體pGL-TATG,DpnⅠ消化PCR產(chǎn)物,酶切產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒。測序證實目的突變點被成功引入(圖3),且沒有引入其它新的突變,即突變質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 不同單體型GRIN2B啟動子轉(zhuǎn)錄效率的比較

通過對pGL-TCTG、pGL-GACA和pGL-TATG這三種GRIN2B啟動子轉(zhuǎn)錄效率分析,兩種細(xì)胞系的所有啟動子轉(zhuǎn)錄活性在SH-SY5Y細(xì)胞中都較HeLa細(xì)胞高(表1、圖4)。

圖3 -421A型質(zhì)粒突變成功測序圖

瞬時轉(zhuǎn)染SH-SY5Y和HeLa細(xì)胞后的報告基因檢測結(jié)果顯示:pGL-TCTG和pGL-GACA兩者的RLA沒有差異(SH-SY5Y細(xì)胞,pGL-TCTG:13.66±1.32,pGL-GACA:12.93±1.63,P=0.149;HeLa細(xì)胞,pGLTCTG:2.81±0.39,pGL-GACA:2.66±0.45,P=0.288)(表1、圖4)。然而,我們檢測到無論是在SHSY5Y還是在HeLa細(xì)胞中,pGL-TATG的轉(zhuǎn)錄活性與pGL-TCTG相比有顯著性差異,轉(zhuǎn)錄活性約增加1.5-1.7倍(SH-SY5Y細(xì)胞,pGL-TATG:20.92±1.66,P=0.000;HeLa細(xì)胞,pGL-TATG:4.67±0.67,P=0.000)(表1、圖4)。

表1 三種 GRIN2B啟動子質(zhì)粒的RLA比較(±s)

表1 三種 GRIN2B啟動子質(zhì)粒的RLA比較(±s)

注:*與相同細(xì)胞系pGL-TCTG的RLA相比有顯著性差異,P＜0.05。

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圖4 不同GRIN2B啟動子轉(zhuǎn)錄效率的比較

2.3 不同處理因素下GRIN2B啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化

對比各種處理因素下GRIN2B啟動子質(zhì)粒的RLA,我們發(fā)現(xiàn)無論是在SH-SY5Y細(xì)胞中,還是在HeLa細(xì)胞中,每種GRIN2B啟動子質(zhì)粒在血清剝奪、Na2S2O4、H2O2及Aβ25-35干預(yù)下的 RLA與非處理組相比均無顯著性差異(P＞0.05),即這些處理因素對GRIN2B啟動子的 RLA無影響(表2,表3)。

表2 三種質(zhì)粒在SH-SY5Y細(xì)胞中不同處理因素下的RLA比較(±s)

表2 三種質(zhì)粒在SH-SY5Y細(xì)胞中不同處理因素下的RLA比較(±s)

注:P值為相同質(zhì)粒不同處理因素下與未處理組相比所得數(shù)值。

p GL-TCTG pGL-TATG pGL-GACA處理因素RLA P RLA P RLA P未處理 13.66±1.32 - 20.92±1.66 - 12.93±1.63 -血清剝奪 14.27±0.93 0.119 21.64±1.63 0.200 13.28±1.58 0.526 Na2S2O4 13.56±1.00 0.785 21.18±1.45 0.620 12.80±1.45 0.793 H2O2 14.12±1.12 0.275 20.82±1.10 0.829 12.67±1.49 0.262 Aβ25-35 14.22±1.23 0.204 21.38±1.95 0.451 13.27±1.72 0.548

表3 三種質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中不同處理因素下的 RLA比較(±s)

表3 三種質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中不同處理因素下的 RLA比較(±s)

注:P值為相同質(zhì)粒不同處理因素下與未處理組相比所得數(shù)值。

處理因素p GL-TCTG pGL-TATG pGL-GACA RLA P RLA P RLA P未處理 2.81±0.39 - 4.67±0.67 - 2.66±0.45 -血清剝奪 3.01±0.39 0.136 4.48±0.65 0.381 2.52±0.410.322 Na2S2O4 2.86±0.50 0.741 4.71±0.68 0.883 2.67±0.410.959 H2O2 2.75±0.43 0.632 4.59±0.66 0.707 2.68±0.430.923 Aβ25-35 3.05±0.42 0.086 4.99±0.48 0.107 2.72±0.460.720

3 討論

GRIN2B啟動子區(qū)有多個轉(zhuǎn)錄起始點,有一個CpG島,缺乏TATA和CAAT盒,并具有神經(jīng)元表達(dá)的選擇性[2-5]。已有研究報道,GRIN2B近似啟動子區(qū)含有多個可能的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)結(jié)合位點[2,5-8]。如果一些基因變異發(fā)生在轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點上,那么堿基的變化就很有可能改變了GRIN2B啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

在熒光素酶報告分析中,我們發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細(xì)胞中各種GRIN2B啟動子的活性都較HeLa細(xì)胞中高,約是HeLa細(xì)胞的5倍左右。這是因為NMDA受體是突觸后膜的一種跨膜蛋白,在神經(jīng)系統(tǒng)中具有高表達(dá)性,NR2B亞基是NMDA受體的重要組成部分,其同樣具有神經(jīng)系統(tǒng)高選擇性[5]。

瞬時轉(zhuǎn)染SH-SY5Y和HeLa細(xì)胞后的報告基因檢測結(jié)果顯示含有pGL-TATG啟動子的轉(zhuǎn)錄活性比pGL-TCTG增加了1.5-1.7倍。pGL-TATG和pGLTCTG相比,只有-421位點上的堿基不同,卻導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性的明顯差異,這表明-421C/A多態(tài)性位點在GRIN2B啟動子啟動轉(zhuǎn)錄方面起到非常重要的作用。含有-421A等位基因的GRIN2B啟動子可能具有更強的轉(zhuǎn)錄活性,從而引起NR2B蛋白表達(dá)增多,而-421C等位基因則使其表達(dá)減少,這可能是其在AD發(fā)病中發(fā)揮作用的主要方面。

為了證實我們之前發(fā)現(xiàn)的4個多態(tài)性位點是否位于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū),我們應(yīng)用MatInspector(http://www.genomatix.de/products/MatInspector/index.html)[9]來進(jìn)一步進(jìn)行評估。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)-421位點為C堿基時,會產(chǎn)生一個可能的鋅指蛋白ras-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ras-responsive element binding protein,RREB)的結(jié)合位點,而當(dāng)此位點是A堿基時,卻沒有顯示可能的轉(zhuǎn)錄因子能與之相結(jié)合。已有研究證實,RREB可能是一種負(fù)性調(diào)控TF,它可下調(diào)一些基因啟動子的活性從而抑制這些蛋白的表達(dá)[10]。此外,通過RNA干擾抑制RREB的表達(dá)可促使一些基因的啟動活性及蛋白表達(dá)增加[11]。因此我們推測,攜帶有-421C等位基因的GRIN2B啟動子可能含有RREB的結(jié)合位點,從而抑制了GRIN2B的轉(zhuǎn)錄水平,而攜帶有-421A等位基因的GRIN2B啟動子卻促使GRIN2B轉(zhuǎn)錄水平升高,上調(diào)NR2B蛋白的表達(dá)。由此可見,RREB可能是GRIN2B啟動子區(qū)的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白,可直接影響GRIN2B的轉(zhuǎn)錄水平。

我們還發(fā)現(xiàn),雖然-200T/G和-1497G/A位點由于堿基的改變,也使GRIN2B啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力和所結(jié)合的蛋白發(fā)生了一些改變,但功能研究證實pGL-TCTG和pGL-GACA的RLA并沒有差異,我們推測可能是因為這些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的蛋白所發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄功能具有相似性,或者啟動子與各種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力的差異性,再或者這些轉(zhuǎn)錄因子在與啟動子相結(jié)合的過程中存在相互作用,而導(dǎo)致并沒有真正引起GRIN2B啟動活性的明顯變化。雖然這只是我們的推論,但之前的研究結(jié)果也證實了-200T/G和-1497G/A多態(tài)性與AD的發(fā)病沒有關(guān)系,這也進(jìn)一步證明了我們的假設(shè)。

已有研究發(fā)現(xiàn)MNDA受體在AD中發(fā)揮的毒性作用與多種環(huán)境因素關(guān)系密切,如中細(xì)胞凋亡[12]、Aβ[13,14]和炎癥[15]等環(huán)境。此外,在對GRIN2B啟動子區(qū)-200T/G的研究中,Miyatake等人[16]還發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)生長因子的環(huán)境下,pGL3-200T的轉(zhuǎn)錄活性明顯增加。然而,我們的研究結(jié)果顯示,各種干預(yù)下并沒有引起GRIN2B啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化。分析原因可能有:一方面,由于GRIN2B啟動子對這些干預(yù)因素敏感性較低,以上變化尚不能引起其轉(zhuǎn)錄活性的改變;另一方面,RREB可能不受以上環(huán)境因素的調(diào)節(jié),以上因素的選擇缺乏特異性;還有可能由于單一的一種環(huán)境因素尚不能成功模擬AD的環(huán)境;最后,由于在體內(nèi)各種因素的相互作用才是AD發(fā)生的真正環(huán)境,這也可能是導(dǎo)致出現(xiàn)以上陰性結(jié)果的主要原因。

通過以上的研究,我們發(fā)現(xiàn)了-421C/A堿基的改變引起了GRIN2B啟動子活性改變,繼而可能引起了NR2B蛋白表達(dá)的變化,從而導(dǎo)致AD的發(fā)病。但是,尋找有意義的對RREB有影響的干預(yù)因素、明確對GRIN2B啟動子敏感的因素,模擬真正AD體內(nèi)的體外環(huán)境還需進(jìn)一步的深入研究,從而明確GRIN2B在AD中的作用機制。

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