柳 影,陳 儇,郭 杰,畢曉穎,李志超,袁長吉*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心,吉林長春130021;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理教研室,吉林長春130021)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)腫瘤,腦膠質(zhì)瘤治療手術(shù)為首選,但由于腦膠質(zhì)瘤具有浸潤生長的特性,與腦組織間無明顯邊界,難以作到全部切除,目前主張綜合治療,即術(shù)后配合以放射治療、化學(xué)治療等。迄今為止大多數(shù)化療藥物常因不易透過血腦屏障,在臨床應(yīng)用中受到很大限制,因此尋找易于透過血腦屏障的有效化療藥物尤為重要。氯化甲基汞(methylmercury chloride,MMC)屬于烷基汞化合物,具有抗腫瘤的多靶點細胞毒作用,具有良好的脂溶性,我們認為其具有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的潛能,提出用氯化甲基汞治療腦膠質(zhì)瘤的新思路,據(jù)此本文通過體外實驗,研究MMC對SGH44膠質(zhì)瘤細胞的殺傷、增殖和細胞凋亡/壞死的影響,為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的化學(xué)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 MMC(Merck),IMDM細胞培養(yǎng)基(Gib-co),四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma),胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)。

1.2 細胞培養(yǎng) SGH44膠質(zhì)瘤細胞株,由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射生物重點實驗室提供,在含有10%胎牛血清的 IMDM培養(yǎng)基中,置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),傳代培養(yǎng)后用于實驗。

1.3 MTT法比色法測定MMC對 SGH44膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制率 移除細胞培養(yǎng)液,加入0.25%胰酶1分鐘消化貼壁細胞,再加入10 ml細胞培養(yǎng)液,用滴管將細胞吹打成單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度,以每孔1×104個SGH44膠質(zhì)瘤細胞鋪96孔培養(yǎng)板,待細胞貼壁后12 h移除培養(yǎng)液,分組加入含不同濃度(0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50 、5.00、10.00 μ mol·L-1)MMC 的 細 胞 培 養(yǎng) 液 100 μ l,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后,每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μ l,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后移除培養(yǎng)液。每孔加入 DMSO 150 μ l,振蕩后用酶標(biāo)儀(Bio-Rad Model 550,美國)570 nm測定吸光度值(A值),計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A/對照組A值)×100%。

1.4 MTT比色法測定MMC對 SGH44膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用 在96孔平底培養(yǎng)皿中每孔加入1×104SGH44膠質(zhì)瘤細胞,培養(yǎng)72h后,在培養(yǎng)基中加入含有不同濃度(0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 μ mol·L-1)的MMC,分別作用 4 、8、16和32 h后,采用MTT法測定細胞吸光度值(A值)。

1.5 流式細胞儀測定MMC對人SGH44膠質(zhì)瘤細胞凋亡/壞死的影響 上述細胞接種于24孔平底培養(yǎng)板中,每孔為1×106細胞,接觸不同濃度MMC(0.075 、0.15 、0.3 和 1.2 μ mol·L-1),培養(yǎng) 12 h 后 ,用0.25%胰蛋白酶消化,用PBS洗滌后加入Hochest 33258 150 μ L(100 g·L-1),37°C 溫育 30 min,再加入100 μ LPI(不含Triton ×100),4°C條件下避光放置30 min,Hochest 33258用氬離子激光激發(fā),波長352 nm,PI激發(fā)波長488 nm,用FACScan流式細胞儀,收集1×104細胞,測定膠質(zhì)瘤細胞凋亡壞死率,用Cellguest軟件進行分析處理。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0 for Windows統(tǒng)計軟件包,數(shù)據(jù)以±s表示,各組細胞存活率比較采用單因素方差分析,細胞存活率各劑量組間比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MMC對SGH44膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用

不同濃度(1.25 、2.50、5.00 和 10.00 μ mol·L-1)MMC作用72 h后,細胞存活率分別為94.2%、48.2%、39.6%和10.6%,顯著低于對照組(P＜0.05),MMC對人SGH44膠質(zhì)瘤細胞殺傷作用呈劑量及時間依賴性,隨濃度的增加和時間的延長而增強,見表1。

表1 氯化甲基汞對SHG44膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用(±s,n=3)

表1 氯化甲基汞對SHG44膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用(±s,n=3)

與對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01

Group Concentration(μ mol·L-1)SHG44 viability(%)Control 0.00 100.0±4.2 MMC 0.08 91.0±20.0 0.16 118.8±4.7 0.31 128.0±6.3 0.63 101.1±21.0 1.25 94.2±8.0 2.50 48.2±8.0*5.00 39.6±1.1*10.00 10.6±2.1*

2.2 MMC對SGH44膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用

不同濃度(2.50、5.00 和 10.00 μ mol·L-1)MMC作用于SGH44膠質(zhì)瘤細胞4、8、16和32 h后細胞存活率明顯低于對照組(P＜0.05),MMC對SGH44膠質(zhì)瘤細胞殺傷作用呈劑量和時間依賴性,隨濃度的增加和時間的延長而增強,見表2。

表2 氯化甲基汞對SHG44膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用(±s,n=3)

表2 氯化甲基汞對SHG44膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用(±s,n=3)

與對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01

Group Concentration(μ mol·L-1)Cell viability(%)(t/h)4 8 16 32 Control 0.00 100.0±19.7 100.0±19.1 100.0±10.4 100.0±14.3 MMC 0.16 81.8±0.4 91.6±13.5 102.0±7.1 103.5±9.3 0.31 77.9±8.2 98.6±2.9 92.6±1.4 94.8±17.6 0.62 79.5±9.7 79.8±0.6 96.3±2.8 68.3±18.5*1.25 78.4±7.9 80.9±1.5 78.6±1.3 42.6±17.3*2.50 56.9±9.9* 33.2±18.3* 57.1±4.8* 22.2±0.9*5.00 50.5±8.7* 32.1±7.2* 35.6±9.9* 20.7±2.9*10.00 15.4±2.7* 18.9±11.7* 37.2±0.9* 13.4±5.6*

2.3 MMC對SGH44膠質(zhì)瘤細胞凋亡/壞死的影響

氯化甲基汞引起SGH44膠質(zhì)瘤細胞凋亡/壞死率與對照組相比明顯增高,接觸 0.075、0.15、0.3、1.2 μ mol·L-1氯化甲基汞 12 h后細胞凋亡/壞死率呈現(xiàn)劑量依賴性增高趨勢(P＜0.01)。結(jié)果表明,MMC可誘導(dǎo)SGH44膠質(zhì)瘤細胞凋亡,見表3。

表3 不同劑量氯化甲基汞對SHG44細胞凋亡和細胞壞死的影響(n=6)

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是發(fā)生在神經(jīng)外胚層的腫瘤,是顱內(nèi)腫瘤最常見的一種,據(jù)統(tǒng)計其發(fā)生率約占全部顱內(nèi)腫瘤的40-50%[1],其生長呈侵襲性,手術(shù)往往難以根治,術(shù)后復(fù)發(fā)率亦較高。近年來,隨著綜合治療理念的不斷更新,放療、化療在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用越來越重要,但即使經(jīng)過綜合治療,平均生存期仍難以超過一年[2]。目前藥物治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要問題是許多新型化療藥物難以透過血腦屏障,使它們的應(yīng)用受到限制,所以尋找一種特異性高、容易通過血腦屏障發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物成為目前腫瘤治療領(lǐng)域的焦點。

氯化甲基汞為烷基汞化合物,結(jié)構(gòu)式為CH3-Hg-CL,碳鏈短,碳汞共價結(jié)合牢固,非電離,具有良好的脂溶性,極易透過血腦屏障。Berlin等人給鼠猴(squirrel monkeys)喂飼含有放射性標(biāo)記甲基汞的乳汁,探討氯化甲基汞的神經(jīng)毒性及其毒代動力學(xué),結(jié)果表明甲基汞在腦中靶向蓄積,腦與血汞的比值為5.6,與Carlson等人報道的結(jié)果相一致[3]。

由于氯化甲基汞具有上述特殊的理化特性,進入腦組織后,與細胞和細胞內(nèi)的亞細胞結(jié)構(gòu)(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體等)的膜、胞漿、核蛋白以及核酸相互作用,從而對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多靶點毒害細胞效應(yīng)。氯化甲基汞具有類放射損傷效應(yīng),可引起DNA斷裂。其烷基結(jié)構(gòu)能與DNA堿基相互作用,在DNA雙鏈內(nèi)形成鏈內(nèi)鏈間交聯(lián),影響DNA的正常復(fù)制[4]。氯化甲基汞也可誘導(dǎo)細胞凋亡/壞死,線粒體是氯化甲基汞作用的主要靶點,氯化甲基汞可抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ,導(dǎo)致不完全氧化產(chǎn)物ROS、自由基的生成[5],亦可影響神經(jīng)元線粒體膜電位,改變其膜透性,使細胞色素C釋放至胞漿并與Apaf-1結(jié)合,引起Caspase級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細胞凋亡/壞死[6-8]。氯化甲基汞干擾發(fā)育階段腦神經(jīng)元細胞周期進程,誘導(dǎo) p21Waf1/Cip1、Gadd45、Gadd153表達,使神經(jīng)元阻滯在 G0/G1、G2/M期[9,10]。

我們既往已經(jīng)應(yīng)用氯化甲基汞抗大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞行體外研究[11],并觀察了氯化甲基汞誘導(dǎo)凋亡的形態(tài)學(xué)改變[12],發(fā)現(xiàn)MMC具有抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤增殖的作用,其機制可能是通過誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡實現(xiàn)的。本實驗結(jié)果表明,MMC對SGH44膠質(zhì)瘤細胞增殖有明顯的抑制作用,并呈劑量依賴性,隨著濃度的增加而增強;MMC對SGH44膠質(zhì)瘤細胞殺傷作用呈劑量及時間依賴性,隨濃度的增加和時間的延長而增強,并可誘導(dǎo)SH44膠質(zhì)瘤細胞的凋亡和壞死。

綜上所述,氯化甲基汞對體外培養(yǎng)的SGH44膠質(zhì)瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用和殺傷作用,誘導(dǎo)細胞凋亡,提示我們氯化甲基汞是一種有潛力的新型抗膠質(zhì)瘤藥物,其作用機制尚待進一步研究。

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