方 翔,丁建東,李開如,姚玉宇,陶紹玉,王 點,馬根山

(1.東南大學附屬中大醫(yī)院心內科,江蘇南京,210009;2.安徽醫(yī)科大學滁州臨床學院,安徽滁州,239000)

心臟的發(fā)育過程是在多種轉錄因子組成的復合物的作用下進行轉錄調節(jié)的。這些復合物包括了超過20種不同的轉錄因子,研究最多的有Nkx2.5、GATA-4、MEF-2,t-box 等轉錄因子[1]。其中Nkx2.5是影響心臟發(fā)育的關鍵性轉錄因子之一。Nkx2.5特異性表達于心房、心室、肌小梁等處的心肌組織[2],在心臟發(fā)育和保持出生后心臟穩(wěn)態(tài),特別是心臟功能成熟以及工作心肌和心臟傳導的功能維持等方面起到非常重要的作用。

本課題組在前期研究中首次在國人散發(fā)性先天性心臟病患者中發(fā)現(xiàn)其Nkx2.5基因外顯子1的第239位發(fā)生了A-G的突變,等位基因的突變頻率在先心病患者與正常人之間差異有統(tǒng)計學意義[3]。為了深入研究轉錄因子Nkx2.5在先天性心臟病發(fā)病過程中的作用,本研究構建含有Nkx2.5的真核表達載體,并將此重組質粒轉染入心肌細胞,觀察細胞形態(tài)學和生物學行為的改變,為后續(xù)的研究奠定一定的基礎?，F(xiàn)就此質粒構建方法報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA連接酶Buffer購自Takara公司;超純質粒DNA純化試劑盒購自Vitagene公司;柱離心式膠回收試劑盒購自Promega公司;溴化乙錠(EB)購自上海生工生物工程公司;質粒pCMV6-XL5-Nkx2.5和pCMV-HA載體購自長沙贏潤生物技術有限公司;大腸桿菌DH5-α由本研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計:參照 Nkx2.5基因序列(Genebank NO.NC_000005.9)的編碼區(qū),利用Primer3軟件設計上游引物和下游引物,上游引物引入EcoRⅠ酶切位點,下游引物引入XholⅠ酶切位點,且使其讀碼框與pCMV-HA多克隆位點讀碼框一致,由上海生工公司合成。上游引物:5′-CCGGAATTCCGATGTTCCCCAGCCCTGCTC-3,(下劃線為EcoRⅠ位點),下游引物:5′-CCG CTCGAG CTACCAGGCTCGGATACCATG-3'(下劃線為XholⅠ位點)。

1.2.2 PCR擴增目的基因:以質粒pCMV6-XL5-Nkx2.5為模板,擴增Nkx2.5編碼區(qū)序列。反應體系為:Taq 酶 0.5 μ L,10×Taq Buffer(含MgCl2)5 μ L,dNTP 2 μ L,Template 2 μ L, 上游引物 1 μ L, 下游引物 1 μ L,dd H2O 38.5 μ L, 共計50 μ L。擴增條件:94℃預變性2 min;94℃30 s,60℃40 s,72℃1 min;72℃10 min,共計30個循環(huán)。

1.2.3 PCR產物膠的回收、連接及轉化:將PCR的產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,膠回收目的基因的DNA片段,回收產物經EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切,與同樣經過 EcoRⅠ和 XholⅠ雙酶切的pCMV-HA載體以T4連接酶16℃連接過夜,連接產物轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌,接種LB平板(AMP 100 mg/L),37℃培養(yǎng)過夜,挑選幾個較大的周圍沒有雜菌的白色菌落,接種于液體LB培養(yǎng)基(AMP 100 mg/L),37℃、160 r/min振蕩過夜。超純質粒DNA純化試劑盒提取質粒,利用PCR及限制性內切酶EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切后送上海上海英俊生物公司測序。

2 結 果

2.1 引物設計

成功的設計出上下游引物,擴增出目的基因。通常PCR引物的長度為18～25個堿基,GC含量應在40%～60%,堿基C和G在整個引物中應均勻分布。應避免在引物的3′末端超過3個C或G,因為這樣有可能增加非特異性引物。同時在兩端可以設計不同的兩個限制酶酶切位點(克隆載體上也應有相應的酶切位點),這樣除了可以定向插入之外,還具有無外源DNA片段插入的線性載體分子自身再連接問題。

2.2 PCR擴增Nkx2.5基因片段

將Nkx2.5片段的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,在GIS凝膠系統(tǒng)中檢測,出現(xiàn)Nkx2.5片段的條帶(約1 kb),結果見圖1,PCR擴增出的片段大小與Nkx2.5片段的理論大小一致,膠回收約1 kb大小片段(圖1)。

圖1 Nkx 2.5的PCR產物電泳圖

2.3 Nkx2.5基因片段克隆至pCMV-HA載體

將Nkx2.5基因克隆至pCMV-HA載體,陽性克隆經酶切鑒定,切出約3.8kb的載體帶和約1kb的片段(圖2),初步推測Nkx2.5已經克隆到pCMV-HA載體。將陽性克隆送上海生工公司測序。測序結果表明,pCMV-HA-Nkx2.5構建正確。

圖2 重組質粒pCMV-Ha-Nkx2.5的酶切鑒定電泳圖

3 討 論

人類Nkx2.5基因,亦稱心臟特異性同源盒基因(cardiac specific homebox,CSX),是一類同源盒轉錄因子,它位于人類染色體5q34-35,總長度為 3125bp,有2個外顯子,cDNA全長 1015 bp,編碼含324個氨基酸的蛋白質,是NK型同源盒基因家族中NK2型成員之一。人類Nkx2.5基因蛋白同源結構域HD含有高度保守的60個氨基酸殘基,是與 DNA結合的必需結構[4]。Nkx2.5在心臟前體細胞的分化、心臟的環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導系統(tǒng)形成以及成熟心臟正常功能的維持中起到重要的調節(jié)作用[5]。Nkx2.5是胚胎發(fā)育過程中的早期標志之一,在胚胎發(fā)育的7.5天即表達于心臟中胚層[6]。在心臟發(fā)育過程中,Nkx2.5最初見于心臟頭褶期心肌源性前體細胞,持續(xù)表達于心肌細胞分化階段,隨后在胚胎、胎兒和成體心肌細胞中保持一定的表達水平。該基因一旦發(fā)生突變可引起先天畸形,如房間隔缺損(atrial septal defect,ASD)、室間隔缺損(ventricular septal defect,VSD)、動脈導管未閉(patent ductus arteriosus,PDA)、肺動脈瓣狹窄(pulmonary stenosis,PS)等。

研究證實Nkx2.5在心臟發(fā)育過程參與心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦利鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、肌細胞增強因子(myocyte enhancer factor,MEF)等基因的表達,ANP和MEF2能促進心臟發(fā)育時心肌細胞調亡,Nkx2.5基因突變后能上調這些調亡基因高表達,使發(fā)育的心肌細胞過度調亡,導致先天性心臟病[7]。Nkx2.5在心臟發(fā)育過程中與其他轉錄因子如 GATA-4、SRF 、Tbx-5、Tbx-2 、dHAND/HAND2等相互作用而調節(jié)心臟的發(fā)育[8]。小鼠的Nkx2.5基因啟動子包含兩個GATA結合域,其與GATA結合后對于胚胎形成早期的心臟、咽和脾的發(fā)育是必需的[9]。許多研究表明,GATA-4和Nkx2.5在蛋白質水平相互作用調節(jié)ANP、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone mrphogenic protein,BMP)和心臟限制性錨蛋白復制蛋白等啟動子的表達[10]。

本研究首先以質粒pCMV6-XL5-Nkx2.5為模板,設計上下游引物成功擴增出Nkx2.5的編碼序列,經雙酶切后與真核表達載體pCMV-HA連接,經PCR、雙酶切及測序鑒定,表明本實驗成功構建了重組真核表達質粒pCMV-HA-Nkx2.5。在后續(xù)的研究中,將重組質粒轉染到小鼠心肌細胞中,觀察心肌細胞形態(tài)學和生物學行為的改變。目前國內還沒有成功構建Nkx2.5重組表達質粒的報道,本實驗為進一步研究轉錄因子Nkx2.5在心臟發(fā)育以及先天性心臟病的發(fā)生過程中的作用奠定基礎。

[1]Wang Y,Morishima M,Zheng M,et al.Transcription factors Csx/Nkx2.5 and GATA4 distinctly regulate expression of Ca2+channels in neonatal rat heart[J].J Mol Cell Cardiol,2007,42(6):1045.

[2]汪 劍,卓莉莉,姜之文,等.CSX/Nkx2.5基因在大鼠胚胎心臟發(fā)育過程中的表達[J].南京醫(yī)科大學學報(自然科學版),2008,28(5):605.

[3]丁建東,李開如,張曉黎,等.轉錄因子Nkx2.5基因突變與先天性心臟病相關性的初步研究[J].中華醫(yī)學雜志,2009,89(16):1114.

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[5]方 翔,丁建東.轉錄因子Nkx2.5與GATA-4在心臟發(fā)育中的作用[J].醫(yī)學綜述,2009,15(22):3366.

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[9]Lien C L,Wu C,Mercer B,et al.Control of early cardiacspecific transcription of Nkx2-5 by a GATA-dependent enhancer[J].Development,1999,126(1):75.

[10]McBride K,Nemer M.Regulation of the ANF and BNP promoters by GATA factors:lessons learned for cardiac transcription[J].Can J Physiol Pharmacol,2001,79(8):673.