蔡嬌陽 李本尚 劉秋霞 湯靜燕

上海交通大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心血液腫瘤科，上海 200127

神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞球富含表達(dá)Nestin細(xì)胞的研究

蔡嬌陽 李本尚 劉秋霞 湯靜燕

上海交通大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心血液腫瘤科，上海 200127

背景與目的：已有研究證實(shí)，懸浮生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞球具有自我更新和增殖的能力，同時(shí)表達(dá)干細(xì)胞的特征性標(biāo)記物。本研究旨在通過分離、培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤獲得腫瘤細(xì)胞球，觀察其在體外的增殖、分化能力，并檢測(cè)其表面特征性標(biāo)志物。方法：取外科手術(shù)切除獲得的神經(jīng)母細(xì)胞瘤瘤塊及骨髓轉(zhuǎn)移患兒的骨髓標(biāo)本，接種于含生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)液中，懸浮培養(yǎng)；加入維甲酸（retinoic acid，RA）誘導(dǎo)細(xì)胞分化；接種裸鼠，比較腫瘤細(xì)胞球與非腫瘤細(xì)胞球裸鼠成瘤情況；利用免疫熒光及RT-PCR法比較腫瘤細(xì)胞球與非腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin表達(dá)的差異。結(jié)果：神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)成腫瘤細(xì)胞球，傳代后仍保持很強(qiáng)的自我更新和增殖能力；腫瘤細(xì)胞球在RA的誘導(dǎo)下分化，產(chǎn)生具有神經(jīng)元形態(tài)特征的子代腫瘤細(xì)胞；1×104個(gè)腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞14 d可形成移植瘤；RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)證實(shí)腫瘤細(xì)胞球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物Nestin。結(jié)論：體外培養(yǎng)獲得的神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞球中富集腫瘤干細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞球中存在Nestin表達(dá)陽性的腫瘤干細(xì)胞。

腫瘤干細(xì)胞； 神經(jīng)母細(xì)胞瘤； 培養(yǎng)； Nestin

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是一種起源于節(jié)后交感神經(jīng)節(jié)的胚胎性惡性腫瘤，占小兒腫瘤的8%～10%，Ⅲ～Ⅳ期 NB 是預(yù)后最差的兒童腫瘤之一，即使達(dá)到完全緩解，其中仍有40%～50%以上的患兒會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)［1］。據(jù)此可以推測(cè)在Ⅲ～Ⅳ期的NB患者中，其腫瘤干細(xì)胞的含量可能高于其他腫瘤。腫瘤干細(xì)胞由于本身基因表達(dá)上的差異，其表面標(biāo)志物的表達(dá)可能與其他細(xì)胞存在差別。1997年Bonnet和Dick在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中分離獲得了腫瘤干細(xì)胞，首次證實(shí)腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞［2］。其后研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體瘤中也廣泛存在腫瘤干細(xì)胞，在對(duì)乳腺癌的研究中，Al-Hajj等［3］研究發(fā)現(xiàn)100個(gè)有CD44+/CD24-/low/Lineage-表型的乳腺癌細(xì)胞即可以成瘤，而其他表型的乳腺癌細(xì)胞則無法成瘤［3-4］。近年來，在前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌，以及星型細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤等腦腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在［5-8］。Mahller等［9］曾報(bào)道，NB腫瘤細(xì)胞球中存在CD133、人腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）和Nestin為陽性表達(dá)的腫瘤干細(xì)胞。但目前關(guān)于NB腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物仍未明確。本研究旨在利用無血清培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)獲得腫瘤細(xì)胞球（tumor sphere，TS）的方法，分離培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞球（neuroblastoma tumor sphere，NBTS），同時(shí)通過觀察其在體外的增殖和分化；采用免疫熒光及RT-PCR方法，對(duì)NBTS細(xì)胞的表面特性進(jìn)行初步的研究，希望能為找到可用于鑒別NB腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的研究提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM/F12培養(yǎng)液、膠原酶和B27購自Gibco公司；人表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、人堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自Invitrogen公司；胰島素、維甲酸（retinoic acid，RA）購自Sigma公司；白蛋白購自Baxter公司；Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自美國(guó) Jackson Immunoresearch Laboratories公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；小鼠抗人Nestin 單克隆抗體購自Abcam公司。BALB/c-nu裸鼠周齡4～6周，體重18～20 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心提供［SCXK（滬）2007-0005］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本取材和NBTS的原代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)取材來自外科手術(shù)切除神經(jīng)母細(xì)胞瘤瘤塊及骨髓轉(zhuǎn)移的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的骨髓標(biāo)本。陽性骨髓標(biāo)本采用Ficoll分離獲得單個(gè)核細(xì)胞；腫瘤組織標(biāo)本通過機(jī)械剪切成1 mm直徑大小，用0.15%膠原酶消化過夜，用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液并重懸于預(yù)先配制的DMEM/F12培養(yǎng)液(含2%B27、EGF 20 ng/mL、bFGF 10 ng/mL、0.4%白蛋白、胰島素5 μg/mL)中，置于培養(yǎng)皿中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。最后采用400目的細(xì)胞濾器過濾，分離TS細(xì)胞與非TS細(xì)胞。

1.2.2 NBTS誘導(dǎo)分化 取懸浮有NBTS的培養(yǎng)液離心后，將細(xì)胞接種于不含生長(zhǎng)因子，而含5 μmol/L RA的完全培養(yǎng)液中，在相差顯光學(xué)微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.3 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 制備TS與非TS細(xì)胞懸液，取樣行錐蟲藍(lán)染色并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107個(gè)/mL備用。將裸鼠隨機(jī)分組，TS細(xì)胞與非TS細(xì)胞各接種4組，每組5只，TS與非TS組接種細(xì)胞數(shù)分別為1×104、1×105、1×106和1×107個(gè)細(xì)胞。在層流超凈工作臺(tái)內(nèi)，取乙醇消毒小鼠右側(cè)腋下皮膚；用100 mL微量注射器抽取相應(yīng)數(shù)量細(xì)胞懸液，分別接種于裸鼠腋下皮下，每日觀察腫瘤形成情況。小鼠12周時(shí)處死，移植瘤病理切片免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示NSE（+）、Syn（+）和S-100（+），證實(shí)為神經(jīng)母細(xì)胞瘤。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)TS與非TS干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的差異 分別取TS與非TS細(xì)胞各107個(gè)抽提總RNA后，在紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定其吸光度值并進(jìn)行定量。之后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的操作步驟，行反轉(zhuǎn)錄獲得到cDNA；以cDNA為模板，通過干細(xì)胞表面標(biāo)志物（Bmi-1、Oct4、Notch-1、Nanog1、Nanog2、Nestin和ABCG2等）的各引物擴(kuò)增目的基因（表1），以GAPDH作為內(nèi)參照，其中Nanog基因設(shè)計(jì)了2對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s 、58 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。行1.5 %瓊脂糖作凝膠電泳鑒定目的基因的表達(dá)，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 Nestin的原位免疫熒光檢測(cè) 經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TS與非TS細(xì)胞的表面標(biāo)志物Nestin的表達(dá)存在差異，故進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證Nestin在TS與非TS細(xì)胞中的表達(dá)差異。用400目的濾網(wǎng)區(qū)分出TS及非TS，將細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后甩片，可見細(xì)胞帖附于載玻片上，隨后進(jìn)行原位免疫熒光染色。用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，0.3% TritonX-100破細(xì)胞膜，5%牛血清白蛋白封閉，加入一抗小鼠抗人Nestin 單克隆抗體（1∶200稀釋）反應(yīng)，再加入二抗Cy3標(biāo)記綿羊抗小鼠IgG反應(yīng)，最后采用DAPI染核，封固，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并攝片。以PBS代替一抗，為陰性對(duì)照。

表 1 RT-PCR擴(kuò)增各目的基因引物序列Tab. 1 The primer sequence of several stem cell marker genes

2 結(jié) 果

2.1 原代NBTS培養(yǎng) 從神經(jīng)母細(xì)胞瘤瘤塊中分離獲得的腫瘤細(xì)胞及從骨髓轉(zhuǎn)移的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的骨髓獲得的單個(gè)核細(xì)胞原代培養(yǎng)5~7 d時(shí)，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，一部分細(xì)胞形成懸浮TS，呈圓形或卵球形，大小不一，球體折光性較強(qiáng)（圖1），其余細(xì)胞未形成細(xì)胞球，部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。1周左右待培養(yǎng)液中懸浮的TS形狀規(guī)則、數(shù)量較多后，取懸浮有TS的培養(yǎng)液離心后棄去半量培養(yǎng)液，重新吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶2的比例傳代，以后每周傳代1次，至20代左右時(shí)TS生長(zhǎng)緩慢，部分貼壁分化。

2.2 NBTS的分化 在含5 μmol/L RA的完全培養(yǎng)液中大部分TS在12 h內(nèi)發(fā)生貼壁生長(zhǎng)的變化。TS細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)4～6 d后細(xì)胞伸出數(shù)個(gè)短的突起而呈多角形，形成假神經(jīng)節(jié)并有神經(jīng)微絲伸出（圖2）。這說明NBTS中的腫瘤干細(xì)胞在RA的誘導(dǎo)下分化，產(chǎn)生具有神經(jīng)元形態(tài)特征的子代腫瘤細(xì)胞。

2.3 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) TS組接種1×104、1×105、1×106和1×107個(gè)細(xì)胞12~14 d即可形成移植瘤（圖3A），而非TS組1×107個(gè)細(xì)胞21 d才可成瘤（圖3B），非TS組1×104、1×105、1×106細(xì)胞觀察至2個(gè)月時(shí)仍未見腫瘤形成。瘤體經(jīng)病理檢查明確為NB。以上結(jié)果可以看出，TS中富含腫瘤干細(xì)胞，表現(xiàn)出異于其他細(xì)胞的強(qiáng)增殖能力。

2.4 RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)證實(shí)NBTS表達(dá)Nestin 借鑒正常干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，尋找腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，選擇Bmi-1、Oct4、Notch-1、Nanog1、Nanog2、Nestin和ABCG2為目的基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TS細(xì)胞與非TS細(xì)胞均表達(dá)Oct4和Bmi-1，而僅TS細(xì)胞表達(dá)Nestin，非TS細(xì)胞不表達(dá)Nestin（圖4），其余干細(xì)胞標(biāo)志物TS細(xì)胞與非TS細(xì)胞均不表達(dá)。進(jìn)一步行免疫熒光檢測(cè)驗(yàn)證Nestin在TS與非TS細(xì)胞中的表達(dá)差異，在熒光顯微鏡下可見TS發(fā)出明亮的紅色熒光，呈細(xì)胞質(zhì)染色模式（圖5），非TS細(xì)胞Nestin陰性，表明TS中存在Nestin陽性的腫瘤干細(xì)胞。

3 討 論

腫瘤的高復(fù)發(fā)率是存在于腫瘤治療中的一個(gè)難題，目前研究認(rèn)為腫瘤的復(fù)發(fā)與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)存在密切相關(guān)［10-12］，CSC對(duì)現(xiàn)行的化療和放療相對(duì)不敏感從而成為日后復(fù)發(fā)的根源。這就要求采取針對(duì)CSC的治療措施，而尋找CSC就成為許多腫瘤治療的當(dāng)務(wù)之急和主攻方向。

除血細(xì)胞外，正常細(xì)胞一般必須貼附在固相表面才能生長(zhǎng)，稱為錨著依賴性生長(zhǎng)，然而腫瘤細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下也能生長(zhǎng)繁殖，形成細(xì)胞球，這些TS可以自我更新和增殖，表達(dá)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物［13-14］。Singh等［15］在2003年報(bào)道了應(yīng)用液體無血清培養(yǎng)液從膠質(zhì)瘤和髓母細(xì)胞瘤中分離獲得具有神經(jīng)干細(xì)胞性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞球，并證實(shí)其為腫瘤干細(xì)胞。在本研究中原代培養(yǎng)的NB細(xì)胞中部分細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的增殖能力，很快增殖形成TS，這表明在TS中有一小部分細(xì)胞為具有顯著的增殖和自我更新能力的CSC；通過比較TS與非TS 兩類細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)TS細(xì)胞具有分化能力及強(qiáng)的裸鼠移植成瘤能力，進(jìn)一步提示NBTS中富集NB腫瘤干細(xì)胞。體外研究證實(shí)，順式維甲酸可誘導(dǎo)分化神經(jīng)母細(xì)胞瘤，加速其增殖分化和成熟［16-17］，與本研究結(jié)果相符。目前順式維甲酸已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床上NB患兒的治療，對(duì)自體造血干細(xì)胞移植后體內(nèi)殘留的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療起到了良好的作用。

為研究NB腫瘤干細(xì)胞的表面特性標(biāo)志物，本課題組共選擇了7種干細(xì)胞共同的特異性標(biāo)志物為目的基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TS細(xì)胞表達(dá)Nestin，而非TS細(xì)胞中不表達(dá)Nestin。進(jìn)一步行免疫熒光染色證實(shí)了Nestin在TS與非TS細(xì)胞中的表達(dá)差異，表明TS中存在Nestin表達(dá)陽性的腫瘤干細(xì)胞。Nestin是一種中等纖維蛋白，它在哺乳動(dòng)物神經(jīng)前體細(xì)胞中高表達(dá)，已被廣泛用作神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志分子［18］，本研究中TS中的腫瘤干細(xì)胞表達(dá)Nestin，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。此外，Vangipuram等［19］報(bào)道認(rèn)為，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物CD133+的NB細(xì)胞較CD133-的NB細(xì)胞，具有更強(qiáng)的對(duì)化療藥物的耐藥性，提示CD133可能為NB腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志之一。本研究在后繼研究中將針對(duì)CD133做進(jìn)一步分析。

到目前為止，國(guó)際上尚未明確特異性的神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。如能在本研究基礎(chǔ)上利用現(xiàn)有的TS培養(yǎng)方法及動(dòng)物模型，采用流式細(xì)胞儀、蛋白質(zhì)組和基因芯片技術(shù)，通過比較以上不同表面標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜、基因表達(dá)譜差異篩選出神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志，分離純化后進(jìn)行其生物性狀的研究，將有助于闡明NB耐藥、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對(duì)設(shè)計(jì)實(shí)施針對(duì)性的靶向治療有著十分重要的意義。

［1］Maris JM, Hogarty MD, Bagatell R, et al. Neuroblastoma［J］.Lancet, 2007, 369: 2106-2120.

［2］Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell［J］. Nat Med, 1997, 3: 730-737.

［3］Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］. PNAS, 2003, 100: 3983-3988.

［4］Shipitsin M, Campbell LL, Argani P, et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity［J］. Cancer Cell, 2007, 11(3):259-273.

［5］Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al. Identification of human brain tumour initiating cells［J］. Nature, 2004, 432: 396-401.

［6］Bao S, Wu Q, McLendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response［J］. Nature, 2006, 444(7120): 687-688.

［7］Wani AA, Sharma N, Shouche YS, et al. Nuclearmitochondrial genomic profiling reveals a pattern of evolution in epithelial ovarian tumor stem cells［J］. Oncogene, 2006,25(47): 6336-6344.

［8］Yi L, Zhou ZH, Ping YF, et al. Isolation and characterization of stem cell-like precursor cells from primary human anaplastic oligoastrocytoma［J］. Mod Pathol, 2007, 20(10): 1061-1068.

［9］Mahller YY, Williams JP, Baird WH, et al. Neuroblastoma cell lines contain pluripotent tumor initiating cells that are susceptible to a targeted oncolytic virus ［J］. PLoS One,2009, 4(1): 4235.

［10］Dingli D, Michor F. Successful therapy must eradicate cancer stem cells［J］. Stem Cells, 2006, 24: 2006-0136.

［11］Clarke MF, Dick JE, Dirks PB, et al. Cancer stem cells:perspective on current status and future directions: AACR workshop on cancer stem cells［J］. Cancer Res, 2006, 66:9339-9344.

［12］Hill RP. Identifying cancer stem cells in solid tumors: case not proven［J］. Cancer Res, 2006, 66: 1891-1895.

［13］Techawattanawisal W, Nakahama K, Komaki M, et al. Isolation of multipotent stem cells from adult rat periodontal ligament by neurosphere-forming culture system［J］. Biocheml Biophysl Res Commun, 2007, 357(4): 917-923.

［14］Shiota M, Heike T, Haruyama M, et al. Isolation and characterization of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells with myogenic and neuronal properties［J］.Exp Cell Res, 2007, 313(5): 1008-1023.

［15］Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al. Identification of human brain tumour initiating cells［J］. Nature, 2004, 432: 396-401.

［16］Veal GJ, Errington J, Redfern CP, et al. Influence of isomerisation on the growth inhibitory effects and cellular activity of 13-cis and all-trans retinoic acid in neuroblastoma cells［J］. Biochem Pharmacol, 2002, 63(2): 207-215.

［17］Reynolds CP, Matthay KK, Villablanca JG, et al. Retinoid therapy of high-risk neuroblastoma［J］. Cancer Lett, 2003,197: 185-192.

［18］Thomas SK, Messam CA, Spengler BA, et al. Nestin is a potential mediator of malignancy in human neuroblastoma cells［J］. J Biol Chem, 2004, 279(2): 27994-27999.

［19］Vangipuram SD, Wang ZJ, Lyman WD. Resistance of stemlike cells from neuroblastoma cell lines to commonly used chemotherapeutic agents［J］. Pediatr Blood Cancer, 2010,54(3): 361-368.

Research on neuroblastoma tumor spheres enrich cells with cancer stem cell properties which are positive for Nestin

CAI Jiao-yang,LI Ben-shang,LIU Qiu-xia,TANG Jing-yan(Department of Hematology Oncology, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China)

TANG Jing-yan E-mail：yantfk@online.sh.cn

Background and purpose：Spheroids have been shown to derive from stem cells tissues. This study isolated and cultured neuroblastoma tumor spheres, observed their growth pattern and differentiation, and investigated their specific markers in order to help isolate neuroblastoma tumor stem cells.Methods：Dissociated cells from tumors or bone marrow were resuspended in serum-free DMEM/F12 supplemented with insulin, human recombinant epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and bovine serum albumin.Assessments of spheroid differentiation were made under the condition that 5 μmol/L retinoic acid was given to those with formed spheres. To assess tumorigenicity, tumor sphere cells and non sphere forming tumor cells were injected into the left axilla of 3 to 4 week-old female nude athymic mice. To detect the expression of different stem cell markers in these two types of tumor cells, immunof l uorescence studies and reverse transcription-PCR for Nestin was performed.Results：Tumor sphere cells showed significant capacity for proliferating, self-renewing and differentiation. Tumor sphere cells had a high tumorigenic potential when compared with non sphere forming tumor cells. Tumor spheres were immunopositive for a neural precursor marker, Nestin. RT-PCR analysis also confirmed that the spheres were positive for Nestin.Conclusion：Our data indicated that neuroblastoma tumor spheres were Nestin positive and might have cancer stem cell properties. These spheroids represent a new approach to identify the molecular determinants of neuroblastoma stem cell and aid in developing new therapeutic strategies for this tumor.

cancer stem cell; neuroblastoma; culture; Nestin

R730.264

A

1007-3639(2010)05-0327-05

博士點(diǎn)新教師基金項(xiàng)目（200802481052）；上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（09ZY88）；上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項(xiàng)基金（jdy08059）；上海市衛(wèi)生局課題（2008026）。

湯靜燕 E-mail:yantfk@online.sh.cn

2010-11-19

2010-04-06）