熊一峰，梅金紅，徐林林，王珊珊，涂 軼

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤［1］，目前多采用手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療，但療效不理想。近年研究顯示，非甾體類抗炎藥與癌癥危險(xiǎn)性降低有關(guān)。2009年6月，我們觀察了新型非甾體類抗炎藥塞來(lái)昔布對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及NF-κB表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討其可能的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(湘雅中心實(shí)驗(yàn)室);塞來(lái)昔布，以二甲基亞砜(DMSO)溶解，0.22 μm濾器濾過(guò)除菌，4℃保存，使用前用培養(yǎng)液配置;TNF-α;DMEM 培養(yǎng)基，噻唑藍(lán)(MTT)，胰酶，F(xiàn)BS，NF-κB p65鼠抗人一抗，MaxVision檢測(cè)試劑盒，DAB染液。

1.2 U251細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將U251細(xì)胞置于含10%FBS，100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細(xì)胞70%～80%融合時(shí)于0.25%胰蛋白酶消化、傳代，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后以1.0×104/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為塞來(lái)昔布組、TNF-α組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。兩組均分別加入 0、10、25、50、100 μmol/L 的塞來(lái)昔布，其中TNF-α組于1 h后每孔加50 ng/ml TNF-α。

1.3 U251細(xì)胞增殖水平及抑制率測(cè)定 采用甲基噻唑藍(lán)(MTT)法。兩組均于培養(yǎng)24 h后每孔加入DMSO溶液150 μl，輕輕震蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白孔調(diào)零，以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值(OD值)，取平均值代表細(xì)胞增殖水平。以對(duì)照組細(xì)胞存活率計(jì)為100%，細(xì)胞抑制率:(1-實(shí)驗(yàn)組OD值 /對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 NF-κB蛋白在U251細(xì)胞內(nèi)分布及核內(nèi)表達(dá)檢測(cè) ①細(xì)胞內(nèi)分布:取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞以5.0×105/ml接種于6孔培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后同1.2分組及處理，各組均于培養(yǎng)1.5 h后用預(yù)冷丙酮室溫固定15 min，PBS漂洗3遍，加穿透劑0.3%TritonX-100作用 15 min，按 MaxVisionTM說(shuō)明書行免疫組化染色，在顯微鏡下觀察NF-κB蛋白在U251細(xì)胞內(nèi)分布情況。②核內(nèi)表達(dá):采用Western blot法。取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞分為四組，A組不予特殊處理，B組予50 ng/ml TNF-α，C組予50 μmol/L塞來(lái)昔布 +50 ng/ml TNF-α，D組予 100 μmol/L塞來(lái)昔布+50 ng/ml TNF-α。各組均采用普利萊核蛋白提取試劑盒提取各組核蛋白，取20 μl蛋白樣品，以10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜及封閉，將膜分別移入含NF-κB p65、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的一抗反應(yīng)液中(工作濃度為1∶500)4℃過(guò)夜;洗膜，浸入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑1 min，X線片曝光。以NF-κB p65灰度值/PCNA代表其核內(nèi)表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示、行方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U251細(xì)胞增殖水平及抑制率 隨塞來(lái)昔布濃度增加，兩組增殖水平均降低、增殖抑制率均升高，組間比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

2.2 NF-κB蛋白在U251細(xì)胞內(nèi)分布及表達(dá) 未行任何處理者p65蛋白在細(xì)胞核內(nèi)外均有表達(dá)，且胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)強(qiáng)于核內(nèi);僅經(jīng)50 ng/ml TNF-α者，p65蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯強(qiáng)于胞質(zhì)內(nèi)(靠近細(xì)胞核表達(dá));而經(jīng)塞來(lái)昔布預(yù)處理者p65蛋白主要表達(dá)在胞質(zhì)內(nèi)，核內(nèi)表達(dá)甚少。NF-κB p65灰度值/PCNA:A、B、C、D 組分別為 1.444 5、3.174 3、0.860 9、0.443 9，兩兩比較P均＜0.05。

表1 二組U251細(xì)胞增殖水平及抑制率(±s)

表1 二組U251細(xì)胞增殖水平及抑制率(±s)

注:與上一濃度比較，*P＜0.05

組別 增殖水平(OD值) 增殖抑制率(%)塞來(lái)昔布組(μmol/L)0 0.929±0.061 0 10 0.774±0.041* 16.62*25 0.608±0.107* 34.51*50 0.416±0.082* 55.20*100 0.299±0.022* 69.86*TNF-α 組(μmol/L)0 1.078±0.125 -7.03 10 0.848±0.099 8.68*25 0.689±0.022* 31.07*50 0.431±0.017* 53.57*100 0.265±0.028* 71.00*

3 討論

人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株和人體真實(shí)的腫瘤性狀具有很強(qiáng)的相似性，是研究膠質(zhì)瘤的常用細(xì)胞株。塞來(lái)昔布為選擇性環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑的代表藥物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛及退熱作用，特點(diǎn)為胃腸道毒副作用小及可長(zhǎng)期耐受等，目前其抗腫瘤作用已引起廣泛關(guān)注，有報(bào)道其可抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)［2，3］。NF-κB 是體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且在腫瘤細(xì)胞抵抗放化療過(guò)程中發(fā)揮一定作用［4～6］。正常情況下，NF-κB由p50/p65組成二聚體，與抑制性κB蛋白結(jié)合成三聚體，以無(wú)活性方式存在于細(xì)胞質(zhì)中;細(xì)胞受TNF-α、IL-1、致癌物等刺激時(shí)κB蛋白被降解，活化的p50/p65進(jìn)入細(xì)胞核，與κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。NF-κB異常活化導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，表現(xiàn)為細(xì)胞無(wú)限增殖和自主分裂，腫瘤形成;另一方面，NF-κB可通過(guò)上調(diào)促細(xì)胞存活基因和抗凋亡基因表達(dá)保護(hù)細(xì)胞使其免于凋亡［7］。p50/p50同源二聚體中p50結(jié)構(gòu)不含有反式激活域，具有識(shí)別并結(jié)合κB序列的能力，但缺乏靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的能力;而p50/p50可競(jìng)爭(zhēng)性抑制p50/p65與κB序列的結(jié)合，對(duì)NF-κB調(diào)控起負(fù)反饋?zhàn)饔?，故p65蛋白為代表NF-κB的最好蛋白亞基。本研究顯示，塞來(lái)昔布濃度為10～100 μmol/L時(shí)兩組細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于濃度為0者且呈濃度依賴性，增殖水平則相反，組間比較無(wú)顯著差異。提示塞來(lái)昔布對(duì)U251細(xì)胞增殖有抑制作用，但與TNF-α無(wú)協(xié)同作用。本研究還顯示，塞來(lái)昔布濃度為50、100 μmol/L時(shí)，NF-κB蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)減少，且呈濃度依賴性。提示塞來(lái)昔布可能參與了對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白如TNF-α的作用，并非真接抑制 NF-κB，此亦可能為其抑制U251細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

總之，塞來(lái)昔布可抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，可能機(jī)制為抑制NF-κB向核內(nèi)移位。

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