魏紹斌 王妍 李白雪

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMT)是婦科疑難病癥，主要表現(xiàn)為盆腔疼痛、痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)異常等，嚴(yán)重影響女性的身體健康和生活質(zhì)量。盡管其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，但越來越多的研究表明，血管形成在EMT的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[1]。血管形成取決于血管形成刺激因子和抑制因子之間，以及效應(yīng)細(xì)胞(主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞)與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互平衡。血管形成相關(guān)因子通過直接、間接或各因子之間的相互作用，促進(jìn)了EMT發(fā)生、發(fā)展。成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科魏紹斌等以濕熱瘀結(jié)立論，擬定了“清濕化瘀、行氣止痛、消癥散結(jié)”治法，研制出院內(nèi)制劑內(nèi)異康復(fù)片，通過實(shí)驗(yàn)研究檢測EMT大鼠異位和在位內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、內(nèi)皮抑制素(ENS)、血管內(nèi)皮生長因子/內(nèi)皮抑制素(V/E)、微血管密度(MVD)及微血管數(shù)目的表達(dá)，探討內(nèi)異康復(fù)片對EMT模型大鼠異位和在位內(nèi)膜的不同影響及其作用環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)，初步闡明其治療EMT抗血管生成的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康性成熟未交配過的雌性SD大鼠，60只，體重180～250 g，一級動(dòng)物，檢疫合格，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號：SCXK(川2008-11)，合格證號：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第6351號。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

內(nèi)異康復(fù)片浸膏：按成人每日用量3 g/kg體重計(jì)算，每毫升浸膏制劑含3 g生藥。由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑科制備。丹莪婦康煎膏(中藥陽性對照藥物)：成人每日用量0.5 g/kg體重，由昆明滇虹藥業(yè)有限公司出品，國藥準(zhǔn)字：Z20025253，產(chǎn)品批號：080601。丹那唑膠囊(西藥陽性對照藥物)：按成人每日用量600 mg/60 kg體重計(jì)算，由上海華聯(lián)制藥有限公司出品，國藥準(zhǔn)字：H31021681，產(chǎn)品批號：080305。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

一抗：VEGF(BA0407)Rabbbit polyclonal IgG，200 μg/ml；ENS (BA1609) Rabbit polyclonal IgG，200 μg/ml；CD31 (BA2211) Rabbit polyclonal IgG，200 μg/ml。均購自湖北武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

二抗：(生物素標(biāo)記的羊抗兔血清)及相應(yīng)的試劑盒均購自北京市中杉生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

光學(xué)顯微鏡，型號：BH-2；數(shù)碼攝像機(jī)，型號：TK-C1381EG；BIOMIAS圖像分析系統(tǒng)；切片機(jī)，型號：AO.802；切片漂烘控溫儀，型號：QO-B；脫水機(jī)，型號：TS-12G；包埋機(jī)，型號：BMJ-3；病理組織包埋冷凍臺。

1.5 分組及給藥

采用自體移植法[2]建立EMT大鼠模型，30天后隨機(jī)抽取動(dòng)物剖腹證實(shí)模型成功，隨機(jī)分為內(nèi)異康復(fù)片浸膏高[6.0 g/(100 g·d)]、中劑量組[(3.0 g/(100 g·d)]、丹那唑組[0.1 g/(kg·d)]、丹莪婦康煎膏組[5.0 g/(kg·d)]、模型組和空白組。內(nèi)異康復(fù)片浸膏高、中劑量組、丹莪婦康煎膏組和丹那唑組灌胃給藥，其余灌胃與內(nèi)異康復(fù)片高劑量組等容積的生理鹽水。以上各組每天給藥一次，連續(xù)30天。

1.6 標(biāo)本的采集與處理

于末次給藥后24小時(shí)，頸椎脫臼處死大鼠，立即剖腹取出異位種植內(nèi)膜組織(根據(jù)造模后抽樣檢測結(jié)果，取子宮中段系膜處的異位種植內(nèi)膜組織)和左子宮(非手術(shù)側(cè))，置于10%中性甲醛溶液中固定保存。

1.7 異位和在位內(nèi)膜VEGF和ENS的染色及檢測

將剖腹取出的異位種植內(nèi)膜組織和左子宮(非手術(shù)側(cè))置于10%中性甲醛液中固定，48小時(shí)后取出，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(片厚4 μm)、采用免疫組化SP法染色。采用Mias圖形分析系統(tǒng)，在400倍視野下選擇異位和在位內(nèi)膜組織的被覆上皮中含陽性物質(zhì)(即棕黃色顆粒物質(zhì))最多的5個(gè)區(qū)域?yàn)g覽，測量陽性物質(zhì)的積分光密度，以此表示VEGF、ENS的表達(dá)情況。

1.8 異位和在位內(nèi)膜MVD的檢測方法

通過標(biāo)記CD31，計(jì)數(shù)著色的毛細(xì)血管和微小血管，凡呈現(xiàn)棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為1個(gè)血管記，采用Mias圖形分析系統(tǒng)，在100倍視野下掃視整張切片，確定微血管最密集的5個(gè)視野(新生血管熱點(diǎn)區(qū))，然后在400倍視野范圍內(nèi)計(jì)數(shù)所有染色的微血管，取5個(gè)視野計(jì)數(shù)結(jié)果的均數(shù)為該切片的微血管數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均由SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，定量指標(biāo)用單因素方差分析，組間比較用最小顯著差數(shù)法(least significant difference，LSD)分析，Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗(yàn)和基于t檢驗(yàn)的保守成對比較(Tamhane’s T2)檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

VEGF、ENS在各組異位和在位內(nèi)膜中主要表達(dá)于被覆上皮細(xì)胞的胞漿和部分基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，部分間質(zhì)細(xì)胞有弱著色，表現(xiàn)為均質(zhì)、棕黃色的顆粒狀或細(xì)絲狀。子宮內(nèi)膜間質(zhì)、子宮平滑肌細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞也呈陽性表達(dá)。

2.1 對異位和在位內(nèi)膜VEGF、ENS表達(dá)的影響

異位內(nèi)膜VEGF的表達(dá)：光鏡下見模型組異位內(nèi)膜中VEGF陽性物質(zhì)呈深棕色分布；各用藥組呈淺棕色分布。半定量檢測結(jié)果示：內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組能明顯降低大鼠異位內(nèi)膜VEGF的表達(dá)(P<0.01)。見表1。

在位內(nèi)膜VEGF的表達(dá)：光鏡下空白組和模型組在位內(nèi)膜中VEGF陽性物質(zhì)呈棕黃色分布，分布較密集；各用藥組與空白組和模型組比較，其深度有減弱的趨勢。半定量檢測結(jié)果示：內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組、丹莪婦康煎膏組VEGF的表達(dá)與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。丹那唑組與其余各組比較差異具有顯著性(P<0.05)。見表1。

異位內(nèi)膜ENS的表達(dá)：光鏡下見模型組異位內(nèi)膜中ENS陽性物質(zhì)呈淺棕色分布；各用藥組與模型組比較，其深度有不同程度的增加，呈深棕色表達(dá)分布。半定量檢測結(jié)果示：內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組較模型組大鼠異位內(nèi)膜ENS的積分光密度值差異具有極顯著性(P<0.01)。見表1。

在位內(nèi)膜ENS的表達(dá)：光鏡下空白組和模型組在位內(nèi)膜中ENS陽性物質(zhì)呈棕黃色分布；各用藥組與空白組和模型組比較，其深度有增強(qiáng)的趨勢。半定量檢測結(jié)果示：內(nèi)異康復(fù)片高劑量組、丹莪婦康煎膏組在位內(nèi)膜ENS的積分光密度數(shù)值與空白組和模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。內(nèi)異康復(fù)片中劑量組、丹那唑組與空白組和模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 對異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜V/E比值的影響

內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組、丹那唑組、丹莪婦康煎膏組異位內(nèi)膜V/E值較模型組均有顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各用藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組、內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組、丹那唑組、丹莪婦康煎膏組在位內(nèi)膜V/E值，與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 對異位和在位內(nèi)膜MVD表達(dá)的影響

異位內(nèi)膜MVD的表達(dá)：光鏡下見模型組異位內(nèi)膜中MVD陽性物質(zhì)呈深棕色表達(dá)分布；各用藥組與模型組比較，其深度有不同程度得降低，且密度程度明顯降低。半定量檢測結(jié)果示：內(nèi)異康復(fù)片高劑量組、丹那唑組均明顯降低大鼠異位內(nèi)膜MVD的表達(dá)，與模型組比較差異具有極顯著性(P<0.01)，內(nèi)異康復(fù)片中劑量組和丹莪婦康煎膏組與模型組比較差異具有顯著性(P<0.05)，各用藥組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

在位內(nèi)膜MVD的表達(dá)：光鏡下見空白組在位內(nèi)膜中MVD陽性物質(zhì)呈深棕色表達(dá)分布；各用藥組及模型組與空白組比較無明顯差別，各組在位內(nèi)膜MVD表達(dá)的半定量檢測結(jié)果示：內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組、丹莪婦康煎膏組與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。丹那唑組與空白組及模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 各組大鼠異位和在位內(nèi)膜VEGF、ENS表達(dá)水平的比較

注：a與模型組比較P<0.01；b與模型組比較P<0.05；c與空白組比較P<0.05；d與丹那唑組比較P<0.05。

表2 各組大鼠異位和在位內(nèi)膜V/E比值的比較

注：a與模型組比較P<0.05。

表3 各組大鼠異位和在位內(nèi)膜MVD表達(dá)水平的比較

注：a與模型組比較P<0.01；b與模型組比較P<0.05；c與空白組比較P<0.05。

表4 各組大鼠異位和在位內(nèi)膜微血管數(shù)目的比較

注：a與模型組比較P<0.01；b與模型組比較P<0.05；c與空白組比較P<0.01。

2.4 對異位和在位內(nèi)膜微血管數(shù)目的比較

內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組、丹那唑組、丹莪婦康煎膏組均明顯降低異位內(nèi)膜微血管數(shù)目，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中內(nèi)異康復(fù)片高劑量組、丹那唑組與模型組比較差異具有極顯著性(P<0.01)。模型組、內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組、丹莪婦康煎膏組與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),各用藥組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。丹那唑組與空白組比較差異具有極顯著性(P<0.01)。見表4。

3 討論

EMT是一種常見的婦科疾病，盡管其發(fā)病機(jī)理不清，但越來越多的證據(jù)表明，異位內(nèi)膜的種植和生長依賴于足夠血液供應(yīng)的建立和維持，新生血管形成(angiogenesis)是EMT發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟。血管形成是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過程，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破就會(huì)激活血管系統(tǒng)，使血管生成過度或抑制血管系統(tǒng)使血管退化。有研究發(fā)現(xiàn)EMT患者異位病灶及其腹腔液中多種血管生長因子明顯增高，子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍，血管形成旺盛[3]，在同一期別中，無論是增生期還是分泌期，異位子宮內(nèi)膜的血管密度及面積和其微血管密度均高于在位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜[4]。

EMT的治療至今仍十分棘手，西藥主要采用激素類藥物治療，近年來采用的促性腺激素類似物治療，雖然有較好療效，但其對性腺軸有明顯的抑制作用，異位內(nèi)膜萎縮的同時(shí)在位內(nèi)膜亦受影響。隨著血管生成在EMT發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的重要作用逐漸被認(rèn)識，有學(xué)者已開始著手于抗血管生成的治療研究，其直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成抑制因子，有更強(qiáng)的針對性，避免了對機(jī)體內(nèi)性激素水平的影響[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)小柴胡湯具有糖皮質(zhì)素樣作用，通過下調(diào)糖皮質(zhì)激素受體，降低細(xì)胞雌激素受體(ER)和雄激素受體(AR)含量，繼而削弱雌激素的作用，降低VEGF水平[6]；理氣膠囊(柴胡、白芍、制香附、莪術(shù)等)可能通過抑制雌、孕激素的分泌，降低VEGF的生成[7]；內(nèi)異方(桃仁、三棱、莪術(shù)、桂枝、鱉甲、夏枯草、生大黃)能使異位內(nèi)膜組織VEGFmRNA表達(dá)水平明顯低于模型組，且隨著加樣量的增加，不同愈加明顯[8]。

“血瘀內(nèi)阻”是公認(rèn)的EMT的根本病機(jī)，本研究結(jié)合四川盆地地域特點(diǎn)提出“濕熱瘀結(jié)”亦是本病主要病機(jī)之一。EMT病變位于盆腔屬下焦，瘀血留著，阻滯氣機(jī)，氣滯水停，水濕內(nèi)聚或復(fù)感濕熱，又可影響氣血運(yùn)行，滯而成瘀，濕熱瘀血二邪互為因果，則漸成癥積且反復(fù)難消。針對上述病機(jī)，以清濕化瘀，行氣止痛，消癥散結(jié)為治法，以《金匱要略》下瘀血方結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)組方形成了醫(yī)院制劑“內(nèi)異康復(fù)片”處方，由大血藤、半枝蓮、大黃、桃仁、土鱉蟲、鱉甲、薏苡仁等組成。通過本實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組均能顯著降低EMT大鼠異位內(nèi)膜VEGF的表達(dá)、MVD值和微血管數(shù)目，并增加ENS的表達(dá)水平，由此可初步得出以下結(jié)論，內(nèi)異康復(fù)片可能通過調(diào)節(jié)異位內(nèi)膜血管生成過程，抑制了異位內(nèi)膜血管的生成，促進(jìn)了異位內(nèi)膜的萎縮而達(dá)到治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，內(nèi)異康復(fù)片高、中劑量組可下調(diào)EMT大鼠在位內(nèi)膜VEGF和上調(diào)ENS的表達(dá)，但V/E值、MVD及微血管數(shù)目的表達(dá)與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即未破壞血管內(nèi)皮刺激因子與抑制因子之間的動(dòng)態(tài)平衡，對血管生成過程無影響。由此可初步推斷，內(nèi)異康復(fù)片治療EMT在有效抑制異位內(nèi)膜血管生成的同時(shí)，對在位內(nèi)膜正常的血管生成過程無影響，這亦是中醫(yī)藥治療EMT特色和優(yōu)勢的體現(xiàn)。

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