張麗雅,楊維成,羅 勇

(上海化工研究院,上海 200062)

近年來,不法商販以提高蛋白質檢測數(shù)值為目的,向飼料和奶制品中非法添加三聚氰胺、三聚氰酸等含氮量高的化工原料,造成了嚴重的食品安全問題,并引發(fā)了世界范圍內對中國造食品安全的信任危機。因此,針對奶制品和其他食品檢測三聚氰胺和三聚氰酸含量是當前食品安全的重要任務之一。

三聚氰胺、三聚氰酸的實驗室檢測方法主要有以下三類:①反相液相色譜法,檢測限通常達2μg/g[1];②氣相色譜-質譜聯(lián)用法,檢測食品中三聚氰胺最低報告水平是10 ng/g[2];③液相色譜-質譜聯(lián)用法,檢測靈敏度通常達到 ng/g水平。在采用同位素稀釋質譜法(Isotope Dilution Mass Spectrometry,IDMS)后,三聚氰胺定量限達到0.1 ng/g[3]。

IDMS是采用與被測物質具有相同分子結構的穩(wěn)定性同位素(15N、13C、2H等)標記的化合物作為內標物質,用高分辨液相色譜-質譜聯(lián)用儀(LC/MS)進行檢測,通過質譜儀測量相應質量數(shù)的離子的m/z并與標準的m/z進行比較達到準確定量的目的。

利用同位素稀釋質譜法檢測食品中的三聚氰胺、三聚氰酸,同位素內標試劑三聚氰胺、三聚氰酸是不可或缺的工具。目前,尚無文獻公開報道同位素標記三聚氰胺、三聚氰酸的合成方法,市售的同位素標記三聚氰胺、三聚氰酸均被跨國公司壟斷。開展同位素標記三聚氰胺、三聚氰酸的合成研究工作有利于打破國外壟斷,完善我國食品安全檢測技術體系,滿足我國食品安全發(fā)展的需求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Nicolet 6700紅外吸收光譜儀:美國尼高力公司產品;LC-20AT高效液相色譜:日本島津公司產品;240C元素分析儀:美國珀金埃爾默公司產品;TSQ Quantum Access液質聯(lián)用儀:美國熱電公司產品;MAT-271氣體同位素質譜計:美國菲尼根公司產品;不銹鋼反應釜:上?；ぱ芯吭涸O計制造,耐壓20 kg,帶有溫控系統(tǒng)。

1.2 主要材料與試劑

15N-氯化銨、13C-尿素:分析純,上?；ぱ芯吭寒a品;二氧六環(huán)、氨水、環(huán)丁砜、二苯醚、DMF、硝基苯:分析純,上海凌峰化學試劑有限公司產品;乙腈:色譜純,上海凌峰化學試劑有限公司產品;丙酮:分析純,上海試劑一廠產品;三聚氰氯:分析純,百靈威公司產品;醋酸銨、庚烷磺酸鈉:色譜純,上海安譜公司產品;檸檬酸:分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.3 三聚氰酸的合成[4-7]及分析

三聚氰酸的合成路線示于圖 1。將 5 g(0.083 mol)尿素、8 mL環(huán)丁砜加入三口燒瓶中,攪拌加熱至120℃,開啟真空泵將體系壓力降至0.013 MPa,繼續(xù)升溫至回流,保持1～2 h。冷卻后,對反應液進行抽濾、水洗,得到三聚氰酸白色晶體。

圖1 三聚氰酸的合成路線

分別采用美國Themo Fisher Scientific公司的 Accela高效液相色譜儀和美國Themo Fisher Scientific公司的TSQ Quantum Access高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀對所得三聚氰酸進行定性和定量分析。

色譜分析:三聚氰酸晶體用乙腈溶解,過0.45μm濾膜后進行色譜分析。色譜條件:采用Hypersil Gold柱(150 mm ×4.6 mm,5μm)作為固定相;V(乙腈)∶V(甲酸水溶液)=95∶5為流動相,等梯度洗脫,流速為0.4 mL/min,柱溫為室溫,檢測波長214 nm。

質譜分析:采用電噴霧(ESI)離子源,負離子模式,噴霧電壓 3 000 V、鞘氣 30 arb、輔助氣5 arb、毛細管溫度 350 ℃、Q1分辨率 0.7 u、掃描范圍m/z=30～150。

1.4 三聚氰胺的合成[8-13]及分析

三聚氰胺的合成路線示于圖2。將7.38 g(0.04 mol)三聚氰氯、40 mL二氧六環(huán)加入到反應釜中,于0～5℃下加入含0.24 mol NH 3的氨水,密封反應器,升溫至140℃,反應4 h。冷卻后,抽濾、水洗、重結晶得到三聚氰胺白色晶體。

分別采用日本島津公司的LC-20AT高效液相色譜儀和美國Themo Fisher Scientific公司的TSQ Quantum Access高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀對所得三聚氰酸進行定性和定量分析。

色譜分析:用50%乙腈水溶液溶解三聚氰胺,過0.45μm濾膜后進行質譜分析。色譜條件:采用 Venusil ASB C18柱(46 mm×150 mm)作為固定相;V(檸檬酸庚烷磺酸鈉溶液)∶V(乙腈)=92∶8作為流動相;檢測波長240 nm;流速為1.0 mL/min。

質譜分析:采用電噴霧(ESI)離子源。三聚氰酸采用負離子模式,噴霧電壓3 000 V、鞘氣30 arb、輔助氣5 arb、毛細管溫度350 ℃、Q1分辨率0.7 u、掃描范圍m/z=30～150。三聚氰胺采用正離子模式,噴霧電壓 4 500 V、鞘氣38 arb、輔助氣8 arb、毛細管溫度350 ℃、Q1分辨率0.7 u、掃描范圍m/z=30～150。

圖2 三聚氰胺的合成路線

2 結果與討論

2.1 13C3-三聚氰酸的合成結果

合成三聚氰酸化學反應式如下:

由以上化學反應可知,尿素經反應(1)發(fā)生裂解反應,此過程較慢;經反應(3)聚合生成三聚氰酸是自發(fā)反應,反應(1)生成的氨氣若不能及時被移走,反應(4)就會大量發(fā)生。反應(1)和反應(2)是平行反應,在溫度低時反應(2)更容易發(fā)生,但是當溫度升高時,縮二脲會發(fā)生分解。

2.1.1 溶劑對三聚氰酸收率的影響

由合成三聚氰酸反應過程可知,升高溫度有利于生成的縮二脲分解,促進縮合反應進行。選擇合適的高沸點溶劑,適當提高反應溫度有利于反應進行,但常壓下回流,反應溫度過高,溶劑在其常壓沸點附近會分解,發(fā)生不期望的副反應。選用高沸點溶劑環(huán)丁砜(285℃)、二苯醚(255 ℃)、DMF(155 ℃)、硝基苯(210 ℃)等作為反應介質進行溫度條件實驗,同時調整反應體系的壓力控制回流溫度,結果列于表1。由表1可知,采用環(huán)丁砜作為反應介質時可獲得良好收率,二苯醚和硝基苯次之,DMF最低;適當保持系統(tǒng)負壓(0.013 MPa),降低溶劑的回流溫度,可以得到更好的收率。表1顯示,以環(huán)丁砜為溶劑,保持系統(tǒng)負壓0.013 MPa,反應的回流溫度控制為205℃,三聚氰酸的收率最高,達83%。

2.1.2 壓力對三聚氰酸收率的影響

以環(huán)丁砜作為反應介質,其與尿素的比例不變,只改變反應體系壓力,其他反應條件按1.3節(jié)進行,結果列于表2。分析表2可知,通過保持系統(tǒng)適度負壓,將反應產生的氨氣及時除去,有利于提高目標產物三聚氰酸的收率。在一定范圍內,三聚氰酸的產率隨體系壓力增大而增大,當反應壓力為0.013 MPa與0.019 MPa時,反應收率達到最大。這主要是由于環(huán)丁砜的回流溫度隨體系壓力增大而升高,溫度升高有助于減少副產物縮二脲的生成,從而提高三聚氰酸收率。但是隨著系統(tǒng)壓力進一步升高到0.024 MPa時,產品呈現(xiàn)黃色,這可能是回流溫度過高,加速了環(huán)丁砜分解所致。因此,優(yōu)選反應壓力為0.013～0.019 MPa。

表1 溶劑對三聚氰酸合成收率的影響

表2 壓力對三聚氰酸收率的影響

2.1.3 反應時間對三聚氰酸收率的影響

1.3 節(jié)中,其他條件不變,僅改變反應時間,實驗結果列于表3。由表3可知,隨著反應時間延長,產品收率上升,并在1.5 h時達到較高收率;隨著反應時間進一步延長,產品收率趨于恒定。表明,反應進行1.5 h即達到平衡,因此三聚氰酸的合成時間控制在1.5 h為宜。

2.1.413C3-三聚氰酸的合成與表征

在上述合成工藝優(yōu)化的基礎上,確定最佳工藝條件為:尿素0.083 mol、環(huán)丁砜8 mL、反應壓力0.013 MPa、反應溫度 205℃、反應時間1.5 h。以13C-尿素(13C豐度為98.50%)為標記前體,進行三聚氰酸合成的豐度實驗。結果顯示,產品收率83.2%。13C3-三聚氰酸的色譜保留時間為3.77 min,與標樣的保留時間一致。采用外標法對其進行定量,純度為99.2%,13C同位素豐度為 98.10%,同位素豐度下降了0.40%。

表3 反應時間對合成三聚氰酸收率的影響

產物表征:用元素分析儀對產物進行元素分析(%),C3H3N3O3實測值(計算值):C 27.82(27.91);H 2.53(2.34);N 32.22(32.56);IR(υ/cm-1,KBr):3 113.8 、3 028(νO-H),1 777.5、1 751.7、1 720(νC=N,三嗪環(huán)中碳氮雙鍵),1 464.3、1 398.5(νC-N,三嗪環(huán)中碳氮單鍵),775.2、754.1為三嗪環(huán)特征峰;MS:m/z=128為三聚氰酸的[M-H]-峰,m/z=85為[C2H 2N2O2]-峰,m/z=42為[N≡C-O]-峰。合成的高豐度同位素標記13C3-三聚氰酸,由于三嗪上碳原子為同位素13C標記,其質量數(shù)增加3個單位,[M-H]-峰為m/z=131,主要碎片離子相應變?yōu)閙/z=87、43。

2.2 15N3-三聚氰胺的合成

2.2.1 反應介質對三聚氰胺收率的影響

三聚氰氯具有三嗪化合物的反應特性:3個Cl原子可分步取代,使用極性介質有利于反應進行[9-10,13]。考慮到主要反應物三聚氰氯和氨水的溶解性,分別選用丙酮、二氧六環(huán)、水、甲苯作為反應介質,反應按1.4節(jié)進行,其他條件不變,只改變反應介質。常壓下各介質在相應的回流溫度下進行反應,實驗結果列于表4。由表4可知,當反應介質為二氧六環(huán)時,產物以三聚氰胺為主。因此,選擇以二氧六環(huán)作為反應介質。

2.2.2 反應溫度對三聚氰胺收率的影響

由于氨水的易揮發(fā)性,實驗采用不銹鋼反應釜。反應按1.4節(jié)進行,以二氧六環(huán)為溶劑,其他條件不變,只改變反應溫度,同時保持體系密閉,實驗結果列于表5。由表5可知,適度升高反應溫度有利于提高三聚氰胺產率,在130～140℃范圍內即可獲得理想的收率。隨著反應溫度進一步升高,產物收率略有下降,因此,反應溫度以130～140℃為宜,此時三聚氰胺的收率＞96%。

表4 反應介質對三聚氰胺收率的影響

表5 反應溫度對三聚氰胺收率的影響

2.2.3 溶劑用量對三聚氰胺收率的影響

1.4 節(jié)反應中,改變溶劑用量,其他條件不變,實驗結果列于表6。三聚氰氯的分步取代反應需要適宜的反應環(huán)境。溶劑量過少,三聚氰氯溶解不夠充分;而溶劑量過多又會造成三聚氰氯濃度降低,影響反應的收率。由表6可以看出,在本實驗的配比下,溶劑二氧六環(huán)用量為40 mL,三聚氰胺收率最高,可達98%。

表6 溶劑用量對合成三聚氰胺的影響

2.2.415N3-三聚氰胺的合成與表征

在上述合成工藝優(yōu)化的基礎上,確定最佳工藝條件為三聚氰氯0.04 mol、二氧六環(huán)40 mL、NH 3 0.024 mol、反應溫度 130～140 ℃、反應時間4 h。以15N-氯化銨(99.55%15N)為標記前體,進行三聚氰胺合成的豐度實驗,產品收率97.2%。15N3-三聚氰胺的色譜保留時間為16.98 min,與標樣的保留時間一致。采用外標法對其進行定量,純度為99.7%,MS檢測15N同位素豐度為99.49%,產物的同位素豐度下降＜0.1%。此結果表明,所合成的15N3-三聚氰胺可以作為同位素內標。

產物表征:用元素分析儀對產物進行元素分析(%),C3N 6H 6實測值(計算值):C 28.44(28.56);N 66.72(66.64);H 4.84(4.80);IR(υ/cm-1,KBr):3 468.6 、3419.3(νN-H),1 685.1、1 649.3(νC=N,三嗪環(huán)中碳氮雙鍵);LC-MS檢測:m/z=127為[M+H]+峰,m/z=110為[M-NH 2]+峰,m/z=85為[C2 N4H 5]+峰,應是母離子[C3N6 H7]+脫掉NCNH 2后形成的子離子,m/z=68為[C2N3H2]+峰,為 C2N4H5+脫去NH 3所得。在高豐度同位素標記15N3-三聚氰胺的質譜圖上,m/z=130為[M+H]+峰,由于3個氨基上N元素均為15N,其質量數(shù)增加3個單位,m/z=112為[C314N 315N2 H4]+峰,m/z=87為[C215N 214N 2H 5]+峰。

3 結 論

(1)設計并完成了適合穩(wěn)定同位素標記用內標物13C3-三聚氰酸、15N3-三聚氰胺的合成工藝。以15N-氯化銨為原料,經分步取代合成得到15N3-三聚氰胺;以13C-尿素為原料,采用高沸點溶劑,經液相合成方法制備得到13C3-三聚氰酸。

(2)考察了合成條件對產品收率的影響,獲得了較優(yōu)的合成工藝。

(3)產品經HPLC、MS檢測,化學純度大于99%,同位素豐度高于98%,可作為同位素內標應用。

[1] FDA.Updated FCCDevelopmental Melamine Quantitation(HPLC-UV)[S].New Hampshire:FDA,2007.

[2] Litzau J,Mercer G,Mulligan K.No.4423 GCMS screen for the presence of melamine,ammeline,ammelide,and cyanuric acid[S].New Hampshire:Lab Inform Bull,2008.

[3] 吳慶慶,范可心,沙偉.基于反相液相色譜-質譜聯(lián)用的高靈敏度三聚氰胺檢測新方法[J].科學通報,2009,54(2):171-176.

[4] 朱文明.固相和液相法合成氰尿酸的對比研究[J].精細化工中間體,2004,34(6):45-46.

[5] 杜培松.液相法氰尿酸合成新工藝[J].四川化工,2003,2:29-31.

[6] Sidney B,Highland P.Prepartion of cyanuric acid:US,3563987[P].1971-02-16.

[7] Karl M,Albert P.Prepartion of cyanuric acid:US,3051708[P].1962-08-26.

[8] Thurston J,Dudley J,Kaiser D.Cyanuric Chloride Derivatives.I:Aminochloro-s-triazines[J].J Am Chem Soc,1951,73(7):2 981-2 983.

[9] Kaiser D,Thurston J,Dudley J.Cyanuric Chloride Derivatives.Ⅱ:Substituted Melamines[J].J Am Chem Soc,1951,73(7):2 984-2 986.

[10]Mur VI.2,4,6-Trichloro-1,3,5-triazine(cyanuryl chloride)and its future applications[J].Rus Chem Rev,1964,33(2):92-103.

[11]Varelis P,Jeskelis R.Preparation of13C3-melamine and13C3-cyanuric acid and their application to the analysis of melamine and cyanuric acid in meat and pet food using liquid chromatographytandem mass spectrometry[J].Food Additives and Contaminants,2008,25(10):1 208-1 215.

[12]彭德厚.由尿素合成三聚氰酸[J].化學工程師,1994,3:49-50.

[13]馬會民,蘇美紅,梁樹權.三嗪類光學探針與標記分析[J].分析化學,2003,31(10):1 256-1 260.