官國(guó)英,劉忠瑞,李麗波,侯惠仁,王晶晶,韓世泉

(中國(guó)原子能科學(xué)研究院同位素研究所,北京 102413)

白蛋白(Albumin,Alb)是血漿的主要成分,由肝臟產(chǎn)生,相對(duì)分子質(zhì)量為66 300。當(dāng)腎臟病變時(shí),腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性發(fā)生改變,孔徑變大,Alb漏出,尿液中Alb升高。尿中白蛋白排出量的多少,可反映腎小球損傷的程度,是診斷腎小球腎病的靈敏指標(biāo)。尿白蛋白測(cè)定用于腎臟病的早期診斷,也是目前檢查糖尿病以及高血壓患者腎臟早期損傷的最靈敏的方法之一[1-2]。尿白蛋白與β2-微球聯(lián)合測(cè)定,可用于鑒別診斷腎臟損傷的部位。尿白蛋白測(cè)定在腎臟移植及腎小球藥物損傷的監(jiān)測(cè)等方面亦有一定的價(jià)值[3]。

傳統(tǒng)的測(cè)定尿白蛋白的方法主要有放射免疫法、免疫比濁法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等。放射免疫法靈敏度、精確度較高,但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜,儀器昂貴;免疫比濁法簡(jiǎn)單方便,但是試劑昂貴,不適合大批量的樣本篩選;高效液相色譜法處理過(guò)程復(fù)雜,操作過(guò)程繁瑣,不適用于臨床推廣應(yīng)用;酶聯(lián)免疫法儀器簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便、快速,適用于臨床檢測(cè)和科研應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

酶標(biāo)儀:奧地利SLT公司產(chǎn)品,電熱培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

Alb、辣根過(guò)氧化物酶(H RP)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過(guò)氧化氫(H 2O2):美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品;Alb多克隆抗體:原子高科股份有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Alb酶標(biāo)記物(Alb-HRP)的制備

采用高碘酸鈉標(biāo)記法對(duì)Alb進(jìn)行酶標(biāo)記[4-5]。稱取1.0 mg HRP溶于0.1 mL雙蒸水中,攪拌下加入0.1 mL新鮮配制的0.06 mol/L高碘酸鈉(NaIO4)水溶液,4℃靜置30 min;取出,攪拌下加入0.1 mL 0.16 mol/L乙二醇水溶液,室溫靜置30 min。將 0.5 mL(1.0 mg)Alb的水溶液加入上述溶液中,混勻后,裝入透析袋對(duì)0.05 mol/L p H 9.5的碳酸鹽緩沖液4℃透析過(guò)夜;次日,將溶液自透析袋取出,加入0.04 mL(5 g/L)新配制的NaBH 4蒸餾水溶液,混勻,4℃下靜置2 h。取出反應(yīng)液,裝入透析袋對(duì)0.02 mol/L p H 7.4的PB 4℃透析過(guò)夜,取出透析液,此即為Alb-HRP。在透析液中加等體積甘油,于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 固相抗體的制備

向聚苯乙烯微量滴定板孔中加入含有Alb多克隆抗體的p H9.6碳酸緩沖液(200μL/孔),置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜,37℃封閉1 h,此酶標(biāo)板可用于免疫反應(yīng)。

2.3 Alb標(biāo)準(zhǔn)品的配制

用含0.2%BSA的0.01 mol/L,p H7.4的PBS將已知濃度的Alb濃液按要求依次稀釋,配制成 1.0、2.0、5.0、10.0 、20.0 和 50 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)品,分裝,凍干,4℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 底物溶液和終止劑

將TMB和H 2O2分別溶于pH 5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液中,使其濃度分別為 0.6、1.2 mmol/L,使用時(shí)以體積比1∶1混合,此即為底物溶液。終止劑為2 mol/L H2SO4溶液。

2.5 Alb-ELISA分析程序

采取一步法加樣程序,以20μL/孔待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和200μL/孔酶標(biāo)記物加入包被有Alb多克隆抗體的微量滴定板中,混勻,37℃溫育40 min,棄反應(yīng)液,用洗滌液(含 0.05%Tween-20)洗 5次,加入底物液 200 μL/孔,避光,37℃下顯色 15 min,以 2 mol/L H 2 SO4溶液以每孔50μL終止顯色,于450 nm處測(cè)定其光密度OD450。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中Alb含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)建立

3.1.1 Alb-HRP滴度的選擇

用含0.2%BSA的PBS將Alb-HRP稀釋為 1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000和 1∶5 000的工作液,用于Alb-ELISA實(shí)驗(yàn),Alb的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)為 0、1.0、20.0 和 50.0 mg/L,分別用 A 、B、F和G表示,其吸光度OD450及各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與A點(diǎn)的吸光度之比(B/B0)列于表1。分析表1可知,Alb-HRP滴度為1∶3 000時(shí),標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)B、F、G 與A 的 B/B0分別為 81.5%、20.0%、11.8%,說(shuō)明曲線的抑制效果好,可以滿足免疫分析的要求。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和 Alb-HRP加樣量對(duì)Alb-ELISA的影響

Alb的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(A 、B、C、D 、E、F和 G,濃度分別為 0、1.0、2.0、5.0 、10.0、20.0 和50.0 mg/L)和 Alb-H RP分別加樣 20μL+200μL、50μL+150μL進(jìn)行Alb-ELISA 實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2。表2顯示,加樣量為20+200 μL 時(shí),B、C 、D 、E 、F 、G 點(diǎn)與 A 點(diǎn)的 B/B0分別為 82.7%、62.7%、39.1%、24.8、17.5、9.7%。此結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線有較高的靈敏度,較好的抑制曲線,可以滿足免疫分析要求。

表1 Alb-HRP滴度的選擇

表2 標(biāo)準(zhǔn)品和Alb-HRP加樣量對(duì)Alb-ELISA的影響

3.2 方法學(xué)鑒定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

按照Alb-ELISA分析程序分析各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的OD450,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD450為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出Alb-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果示于圖1。同時(shí)測(cè)定20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)的OD450,以其平均值減去2s計(jì)算其分析靈敏度為0.28 mg/L。

圖1 Alb-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.2 精密度

重復(fù)測(cè)定3份不同濃度的Alb樣品,觀察批內(nèi)、批間變異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表 3。表3顯示,批內(nèi)變異為2.63%～5.28%,批間變異為2.40%～4.26%。該結(jié)果表明,本工作所研制的試劑盒的精密度滿足免疫分析的要求。

表3 Alb-ELISA試劑盒的批內(nèi)批間變異

3.2.3 準(zhǔn)確性

取3份不同濃度的Alb樣品分別加入已知濃度的Alb標(biāo)準(zhǔn)品中,測(cè)定Alb回收率,結(jié)果列于表4。表4顯示,回收率為95.0%～106.4%,符合免疫分析要求。

表4 樣品回收實(shí)驗(yàn)

3.2.4 稀釋實(shí)驗(yàn)

取Alb含量較高的樣品用Alb“零”標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行倍比稀釋,測(cè)定結(jié)果列于表 5。經(jīng)計(jì)算,Alb測(cè)定值與稀釋度線性相關(guān)方程為y=32.81x+0.72,相關(guān)系數(shù)為r=0.997 4,該結(jié)果符合免疫分析要求。

表5 樣品倍比稀釋實(shí)驗(yàn)

3.3 正常尿液樣品的檢測(cè)

采用所建立的白蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)52份正常人尿樣品,測(cè)定結(jié)果顯示,其白蛋白含量小于12 mg/L,與文獻(xiàn)[6]基本一致,符合臨床測(cè)定要求。

4 小 結(jié)

本試劑盒通過(guò)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn),找到合適的反應(yīng)體系,建立了Alb酶聯(lián)免疫分析方法,方法的分析靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、臨床測(cè)定值均達(dá)到免疫分析要求。

[1] 戴世榮.尿微量蛋白在糖尿病腎病中的應(yīng)用價(jià)值[J].臨床檢驗(yàn),2002,15(5):506.

[2] 陳玉霞,李鳳敏,代軍,等.尿微量白蛋白在高血壓病腎損害診斷中的價(jià)值探討[J].甘肅科技,2006,22(6):193-194.

[3] 王自正.現(xiàn)代標(biāo)記免疫學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2000:249.

[4] 郭春祥,郭錫瓊.介紹一種簡(jiǎn)單、快速的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物酶標(biāo)記抗體的過(guò)碘酸鈉法[J].免疫學(xué)雜志,1983,33:97-100.

[5] 劉佳寧,劉一兵,賈娟娟,等.促黃體生成激素酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立[J].同位素,2010,23(1):28-33.

[6] 朱敏,邵愛(ài)華,張哲,等.各種腎病患者尿微量蛋白測(cè)定結(jié)果觀察[J].浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,27(5):31-32.