張 振,法萍萍,李金龍,胡志明,高基民

(南方醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院 生物治療研究所,廣東 廣州 510515)

腫瘤疫苗是目前最具吸引力的腫瘤治療方法,通過基因修飾或細(xì)胞表面錨定修飾技術(shù)將具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子修飾腫瘤細(xì)胞制成新型腫瘤細(xì)胞疫苗,是腫瘤疫苗研究的新策略。白介素4(Interleukin-4,IL-4)又名B細(xì)胞生長因子,對多種腫瘤具有抑制作用。包括誘導(dǎo)宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng),抑制腫瘤血管生成[1-2]。鏈親和素(Streptavidin,SA)是由親和素鏈霉菌產(chǎn)生的非糖基化同源四聚體蛋白。它能與生物素緊密非共價(jià)結(jié)合,由于SA可與生物素快速且?guī)缀醪豢赡娴膹?qiáng)力結(jié)合,以及生物素較容易摻入各種生物分子(如蛋白質(zhì),核酸和脂多糖)中,即生物素化,故SA-生物素間的強(qiáng)力作用可用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域[3]。本文研制的SA標(biāo)記的鼠IL-4(mIL-4-SA)雙功能融合蛋白,通過生物素和SA的高效結(jié)合,把蛋白直接錨定于生物素化的腫瘤細(xì)胞表面,可持續(xù)維持mIL-4在腫瘤局部的有效濃度。另外,也可以將融合蛋白錨定于滅活腫瘤細(xì)胞表面,制備腫瘤疫苗,以便產(chǎn)生更為有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)[4]。本文對mIL-4-SA基因克隆,融合蛋白表達(dá)純化,復(fù)性及其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究,為研制IL-4表面錨定修飾的新型腫瘤細(xì)胞疫苗打下了基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌株及細(xì)胞

菌株 E.coli BL21(DE3)、DH5α購自北京鼎國公司;SA-pET21質(zhì)粒為本室保存;小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10、親和素鏈霉菌購自ATCC。

1.2 試劑

各種限制性內(nèi)切酶均購自 Promega公司;Ni-NTA螯合色譜填料購自Qiagen公司;偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔IgG購自北京鼎國公司;Western blotting檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司;兔抗鼠IL-4單抗購自Merck公司;硝酸纖維素膜購自PALL公司;mIL-4標(biāo)準(zhǔn)品購自Peprotech公司。

2 方 法

2.1 目的基因及引物設(shè)計(jì)

提取ConA活化的小鼠脾細(xì)胞的RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,設(shè)計(jì)上游引物 CCCATATGCATATCCACGGATGCGACAA(NdeⅠ酶切位點(diǎn)),下游引物CGGAATTCCGAGTAATCCATTTGCATGA(EcoRⅠ酶切位點(diǎn)),加入PCR相關(guān)試劑進(jìn)行循環(huán),反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性45 s,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選和鑒定

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,雙酶切,SA-pET21質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,切膠回收空載體。T4DNA連接酶16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,于卡那霉素平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng),挑取單克隆菌落加入T7上游引物和mIL-4下游引物行PCR鑒定,陽性者提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定,鑒定正確送質(zhì)粒測序。

2.3 重組蛋白的表達(dá)

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,接種于LB液體培養(yǎng)基5 mL中,培養(yǎng)至吸光度(A)值為0.4～0.6時(shí),IPTG誘導(dǎo),表達(dá)情況用12%SDS-PAGE鑒定。挑取表達(dá)高的菌落進(jìn)行大量培養(yǎng)誘導(dǎo),收集菌體,12%SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況。

2.4 包涵體的提取

按1∶10應(yīng)用菌體裂解液重懸菌體,4℃攪動(dòng)30 min,冰浴中超聲20 s×10次(間隔 30 s),超聲破碎后,4℃,12000×g離心30 min,收集沉淀。按1∶10依次用洗滌液A(20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,pH 8.0)、洗滌液B(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,2 mmol/L巰基乙醇,0.1%TritonX-100,pH 8.0)、洗滌液C(20 mmol/L Tris-HCl,2 mol/L尿素,2 mmol/L EDTA,pH 8.0)、洗滌液D(20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,50%異丙醇,pH 8.0)、洗滌液E(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)洗滌包涵體。12000×g離心15 min,沉淀為包涵體。

2.5 mIL-4-SA的純化

將包涵體用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(含8 mol/L尿素,5 mmol/L巰基乙醇)溶解,4℃攪動(dòng)30 min。12000×g離心15 min,取上清上樣于Ni-NTA,用平衡液(50 mmol/L磷酸鈉緩沖液,8 mol/L尿素)沖洗至樣品A280恢復(fù)至基線,分別應(yīng)用不同濃度的咪唑溶液進(jìn)行洗脫,收集洗脫峰,12%SDS-PAGE檢測純化情況。

2.6 融合蛋白的復(fù)性

將蛋白濃度調(diào)整至0.1～0.2 mg/mL,在大于20倍體積的透析液(20 mmol/L Tris-HCl,4 mol/L尿素,1 mmol/L還原型谷胱甘肽,0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽,1 mmol/L EDTA)4℃透析復(fù)性,逐漸降低尿素濃度,每12 h換液1次,最終換用pH 7.4磷酸鹽緩沖液透析12 h,離心除去不溶物,收集上清。

2.7 Western blotting鑒定

12%SDS-PAGE分離蛋白,利用半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉于37℃封閉2 h后,加入兔抗鼠IL-4單克隆抗體,37℃孵育1 h,加入偶聯(lián)HRP的羊抗兔IgG,37℃孵育1 h,洗滌后用DAB試劑盒顯色。

2.8 mIL-4-SA生物學(xué)活性測定

制備C57小鼠胸腺細(xì)胞懸液,用含 1 μ g/mL ConA的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。于96孔培養(yǎng)板中每孔加入胸腺細(xì)胞懸液100 μ L,分別加入一系列稀釋的mIL-4-SA融合蛋白和mIL-4標(biāo)準(zhǔn)品,每孔設(shè)3復(fù)孔。于37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h,采用MTT法測定細(xì)胞增殖。因mIL-4-SA的相對分子質(zhì)量(Mr)為mIL-4的2倍,mIL-4-SA融合蛋白的初始濃度為200 ng/mL,IL-4標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度為100 ng/mL,其活性為2×106U/mg。

2.9 流式細(xì)胞儀檢測mIL-4-SA對腫瘤細(xì)胞的修飾效果

取生長狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/mL,加入Sulfo-NHS-LC-Biotin使其終濃度為1 mg/mL,37℃反應(yīng)30 min,加入mIL-4-SA作用60 min,洗滌細(xì)胞后加入兔抗鼠IL-4單克隆抗體,37℃作用30 min后洗滌細(xì)胞2次,加入FITC標(biāo)記的羊抗兔 IgG 10 μ L,室溫避光 30 min,洗滌后取洗液 100 μ L重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測,分析mIL-4-SA對腫瘤細(xì)胞的修飾效果。

3 結(jié) 果

3.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒應(yīng)用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切,獲得與預(yù)期大小一致的片段。經(jīng)核苷酸序列測定,準(zhǔn)確無誤。

圖1 重組mIL-4-SA-pET21的酶切鑒定Fig.1 Identification of resultant expression plasmid mIL-4-SA-pET21

3.2 mIL-4-SA融合蛋白的表達(dá)純化和復(fù)性

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)篩選獲得表達(dá)工程菌,SDS-PAGE顯示(圖2),在Mr32200處有蛋白條帶,而未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌在此處未見蛋白條帶,薄層掃描分析,目的蛋白占總蛋白的35%。工程菌經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)誘導(dǎo),超聲裂解后,目的蛋白主要存在于包涵體中,用Ni-NTA純化,經(jīng)透析復(fù)性,可獲得有活性的融合蛋白。

3.3 Western blotting鑒定

結(jié)果證實(shí),制備的mIL-4-SA融合蛋白能與IL-4單克隆抗體結(jié)合,發(fā)生顯色反應(yīng)(圖3)。

3.4 生物學(xué)活性測定

用小鼠活化胸腺細(xì)胞增殖法測定融合蛋白的生物學(xué)活性,以 mIL-4標(biāo)準(zhǔn)品為對照(圖 4)。經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩者的生物學(xué)活性無顯著性差異(P＞0.05)。融合蛋白的活性為1×106U/mg。

3.5 流式細(xì)胞儀檢測

用兔抗鼠IL-4單克隆抗體及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG對錨定在生物素化的B16F10表面上mIL-4-SA融合蛋白進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,左峰為未修飾的細(xì)胞(陰性對照),而右峰為錨定修飾的細(xì)胞(圖5)。結(jié)果顯示mIL-4-SA融合蛋白的錨定率為96.69%。

4 討 論

新型腫瘤疫苗是腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn),將具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子通過基因修飾或細(xì)胞表面錨定技術(shù)修飾腫瘤細(xì)胞制成疫苗是腫瘤疫苗研究的新策略。由于基因轉(zhuǎn)染存在轉(zhuǎn)移效率低以及病毒載體的潛在安全性問題,難以在臨床上廣泛應(yīng)用。

圖5 mIL-4-SA對生物素化的B16F10細(xì)胞錨定的流式細(xì)胞檢測Fig.5 Modified rate of mIL-4-SA on biotinylated B16F10 cells by FACS

近年來,我們利用細(xì)胞膜表面易生物素化和生物素與SA高效而超強(qiáng)結(jié)合這兩個(gè)特性建立了細(xì)胞膜表面錨定修飾技術(shù)平臺(tái),使具有免疫佐劑作用的細(xì)胞因子錨定在腫瘤細(xì)胞表面,以增強(qiáng)腫瘤疫苗誘導(dǎo)機(jī)體主動(dòng)免疫的效果。我們研制的SA-GM-CSF融合蛋白對黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行錨定修飾制成的腫瘤疫苗,獲得了良好的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果[4]。

IL-4傳統(tǒng)上被認(rèn)為是誘導(dǎo)體液勉疫應(yīng)答的細(xì)胞因子。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外均有抗腫瘤作用,IL-4基因?qū)肽[瘤,可以降低其致瘤性,實(shí)驗(yàn)證實(shí)應(yīng)用IL-4轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞制備疫苗,可以導(dǎo)致腫瘤的縮小,這種作用通過天然免疫和特異性免疫應(yīng)答實(shí)現(xiàn)[5-7],應(yīng)用IL-4轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞,皮下預(yù)防接種,能夠有效抑制大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長,延長其生存期[8-9]。因此,IL-4在腫瘤的治療中有良好的前景。本文制備了mIL-4-SA融合蛋白,希望通過生物素和SA的結(jié)合,將IL-4直接錨定于生物素化的腫瘤細(xì)胞表面,制備腫瘤疫苗,以提高疫苗的抗腫瘤效應(yīng)。目前,相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。

本文成功構(gòu)建了mIL-4-SA-pEt21的質(zhì)粒,在構(gòu)建過程中,在IL-4和SA間引入甘氨酸、絲氨酸的連接肽(17肽),有助于融合蛋白中各單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊,從而保存各自的生物活性。設(shè)計(jì)中引入組氨酸標(biāo)簽,利用二價(jià)陽離子與組氨酸結(jié)合的性質(zhì),用一步螯合色譜即可將表達(dá)的蛋白純度提高至95%,純化方法簡單、效率高。由于融合蛋白為包涵體表達(dá),且IL-4中含有6個(gè)半胱氨酸,因此,復(fù)性成為難點(diǎn)。本文在復(fù)性過程中加入谷胱甘肽,精氨酸,有利于蛋白質(zhì)的正確折疊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本文研制的mIL-4-SA融合蛋白具有雙功能活性,即能夠錨定于生物素化的腫瘤細(xì)胞表面,錨定率達(dá)96.69%,且同時(shí)具有IL-4的活性。在初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出高效的抗腫瘤功能。IL4-SA融合蛋白的研制有可能為腫瘤治療提供一種新的方法。

[1]Paul W E,Ohara J.B-cell stimulatory factor-1/interleukin 4[J].Annu Rev Immunol,1987,5:429-459.

[2]Okada H,Kuwashima N.Gene therapy and biologic therapy with interleukin-4[J].Curr Gene Ther,2002,2(4):437-450.

[3]Sano T,Cantor C R.Streptavidin-containing chimeric proteins:design and production[J].Methods Enzymol,2000,326:305-311.

[4]Gao J,Huang S,Li M,et al.GM-CSF-surface-modified B16.F10 melanoma cell vaccine[J].Vaccine,2006,24(25):5265-5268.

[5]Yu J S,Wei M X,Chiocca E A,et al.Treatment of glioma by engineered interleukin 4-secreting cells[J].Cancer Res,1993,53(13):3125-3128.

[6]Eguchi J,Hiroishi K,Ishii S,et al.Interleukin-4 gene transduced tumor cels promote a potent tumor-specific Th1-type response in cooperation with interferon-alpha transduction[J].Gene Ther,2005,12(9):733-741.

[7]Rissoan M C,Soumelis V,Kadowaki N,et al.Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation[J].Science,1999,283(5405):1183-1186.

[8]Kawakami K,Kawakami M,Puri R K.Overexpressed cell surface interleukin-4 receptor molecules can be successfully targeted for antitumor cytotoxin therapy[J].Crit Rev Immunol,2001,21(1-3):299-310.

[9]Okada H,Villa L,Attanucci J,et al.Cytokine gene therapy of gliomas:effective induction of therapeutic immunity to intracranial tumors by peripheral immunization with interleukin-4 transduced glioma cells[J].Gene Ther,2001,8(15):1157-1166.