張 振,法萍萍,李金龍,胡志明,高基民

(南方醫(yī)科大學 生物技術學院 生物治療研究所,廣東 廣州 510515)

腫瘤疫苗是目前最具吸引力的腫瘤治療方法,通過基因修飾或細胞表面錨定修飾技術將具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子修飾腫瘤細胞制成新型腫瘤細胞疫苗,是腫瘤疫苗研究的新策略。白介素4(Interleukin-4,IL-4)又名B細胞生長因子,對多種腫瘤具有抑制作用。包括誘導宿主的抗腫瘤免疫反應,抑制腫瘤血管生成[1-2]。鏈親和素(Streptavidin,SA)是由親和素鏈霉菌產(chǎn)生的非糖基化同源四聚體蛋白。它能與生物素緊密非共價結(jié)合,由于SA可與生物素快速且?guī)缀醪豢赡娴膹娏Y(jié)合,以及生物素較容易摻入各種生物分子(如蛋白質(zhì),核酸和脂多糖)中,即生物素化,故SA-生物素間的強力作用可用于生物醫(yī)學的許多領域[3]。本文研制的SA標記的鼠IL-4(mIL-4-SA)雙功能融合蛋白,通過生物素和SA的高效結(jié)合,把蛋白直接錨定于生物素化的腫瘤細胞表面,可持續(xù)維持mIL-4在腫瘤局部的有效濃度。另外,也可以將融合蛋白錨定于滅活腫瘤細胞表面,制備腫瘤疫苗,以便產(chǎn)生更為有效的抗腫瘤免疫反應[4]。本文對mIL-4-SA基因克隆,融合蛋白表達純化,復性及其生物學功能進行了初步研究,為研制IL-4表面錨定修飾的新型腫瘤細胞疫苗打下了基礎。

1 材 料

1.1 菌株及細胞

菌株 E.coli BL21(DE3)、DH5α購自北京鼎國公司;SA-pET21質(zhì)粒為本室保存;小鼠黑色素瘤細胞B16F10、親和素鏈霉菌購自ATCC。

1.2 試劑

各種限制性內(nèi)切酶均購自 Promega公司;Ni-NTA螯合色譜填料購自Qiagen公司;偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔IgG購自北京鼎國公司;Western blotting檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司;兔抗鼠IL-4單抗購自Merck公司;硝酸纖維素膜購自PALL公司;mIL-4標準品購自Peprotech公司。

2 方 法

2.1 目的基因及引物設計

提取ConA活化的小鼠脾細胞的RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,設計上游引物 CCCATATGCATATCCACGGATGCGACAA(NdeⅠ酶切位點),下游引物CGGAATTCCGAGTAATCCATTTGCATGA(EcoRⅠ酶切位點),加入PCR相關試劑進行循環(huán),反應條件:94℃預變性3 min,94℃變性45 s,55℃復性45 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán)后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2.2 重組質(zhì)粒的構建、篩選和鑒定

將PCR產(chǎn)物進行切膠回收,雙酶切,SA-pET21質(zhì)粒進行雙酶切,切膠回收空載體。T4DNA連接酶16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,于卡那霉素平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng),挑取單克隆菌落加入T7上游引物和mIL-4下游引物行PCR鑒定,陽性者提取質(zhì)粒,進行酶切鑒定,鑒定正確送質(zhì)粒測序。

2.3 重組蛋白的表達

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,接種于LB液體培養(yǎng)基5 mL中,培養(yǎng)至吸光度(A)值為0.4～0.6時,IPTG誘導,表達情況用12%SDS-PAGE鑒定。挑取表達高的菌落進行大量培養(yǎng)誘導,收集菌體,12%SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。

2.4 包涵體的提取

按1∶10應用菌體裂解液重懸菌體,4℃攪動30 min,冰浴中超聲20 s×10次(間隔 30 s),超聲破碎后,4℃,12000×g離心30 min,收集沉淀。按1∶10依次用洗滌液A(20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,pH 8.0)、洗滌液B(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,2 mmol/L巰基乙醇,0.1%TritonX-100,pH 8.0)、洗滌液C(20 mmol/L Tris-HCl,2 mol/L尿素,2 mmol/L EDTA,pH 8.0)、洗滌液D(20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,50%異丙醇,pH 8.0)、洗滌液E(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)洗滌包涵體。12000×g離心15 min,沉淀為包涵體。

2.5 mIL-4-SA的純化

將包涵體用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(含8 mol/L尿素,5 mmol/L巰基乙醇)溶解,4℃攪動30 min。12000×g離心15 min,取上清上樣于Ni-NTA,用平衡液(50 mmol/L磷酸鈉緩沖液,8 mol/L尿素)沖洗至樣品A280恢復至基線,分別應用不同濃度的咪唑溶液進行洗脫,收集洗脫峰,12%SDS-PAGE檢測純化情況。

2.6 融合蛋白的復性

將蛋白濃度調(diào)整至0.1～0.2 mg/mL,在大于20倍體積的透析液(20 mmol/L Tris-HCl,4 mol/L尿素,1 mmol/L還原型谷胱甘肽,0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽,1 mmol/L EDTA)4℃透析復性,逐漸降低尿素濃度,每12 h換液1次,最終換用pH 7.4磷酸鹽緩沖液透析12 h,離心除去不溶物,收集上清。

2.7 Western blotting鑒定

12%SDS-PAGE分離蛋白,利用半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉于37℃封閉2 h后,加入兔抗鼠IL-4單克隆抗體,37℃孵育1 h,加入偶聯(lián)HRP的羊抗兔IgG,37℃孵育1 h,洗滌后用DAB試劑盒顯色。

2.8 mIL-4-SA生物學活性測定

制備C57小鼠胸腺細胞懸液,用含 1 μ g/mL ConA的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×107/mL。于96孔培養(yǎng)板中每孔加入胸腺細胞懸液100 μ L,分別加入一系列稀釋的mIL-4-SA融合蛋白和mIL-4標準品,每孔設3復孔。于37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h,采用MTT法測定細胞增殖。因mIL-4-SA的相對分子質(zhì)量(Mr)為mIL-4的2倍,mIL-4-SA融合蛋白的初始濃度為200 ng/mL,IL-4標準品的初始濃度為100 ng/mL,其活性為2×106U/mg。

2.9 流式細胞儀檢測mIL-4-SA對腫瘤細胞的修飾效果

取生長狀態(tài)良好的B16F10細胞,調(diào)節(jié)細胞濃度為5×106/mL,加入Sulfo-NHS-LC-Biotin使其終濃度為1 mg/mL,37℃反應30 min,加入mIL-4-SA作用60 min,洗滌細胞后加入兔抗鼠IL-4單克隆抗體,37℃作用30 min后洗滌細胞2次,加入FITC標記的羊抗兔 IgG 10 μ L,室溫避光 30 min,洗滌后取洗液 100 μ L重懸細胞,流式細胞儀檢測,分析mIL-4-SA對腫瘤細胞的修飾效果。

3 結(jié) 果

3.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒應用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切,獲得與預期大小一致的片段。經(jīng)核苷酸序列測定,準確無誤。

圖1 重組mIL-4-SA-pET21的酶切鑒定Fig.1 Identification of resultant expression plasmid mIL-4-SA-pET21

3.2 mIL-4-SA融合蛋白的表達純化和復性

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)篩選獲得表達工程菌,SDS-PAGE顯示(圖2),在Mr32200處有蛋白條帶,而未經(jīng)誘導的工程菌在此處未見蛋白條帶,薄層掃描分析,目的蛋白占總蛋白的35%。工程菌經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)誘導,超聲裂解后,目的蛋白主要存在于包涵體中,用Ni-NTA純化,經(jīng)透析復性,可獲得有活性的融合蛋白。

3.3 Western blotting鑒定

結(jié)果證實,制備的mIL-4-SA融合蛋白能與IL-4單克隆抗體結(jié)合,發(fā)生顯色反應(圖3)。

3.4 生物學活性測定

用小鼠活化胸腺細胞增殖法測定融合蛋白的生物學活性,以 mIL-4標準品為對照(圖 4)。經(jīng)SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,兩者的生物學活性無顯著性差異(P＞0.05)。融合蛋白的活性為1×106U/mg。

3.5 流式細胞儀檢測

用兔抗鼠IL-4單克隆抗體及FITC標記的羊抗兔IgG對錨定在生物素化的B16F10表面上mIL-4-SA融合蛋白進行流式細胞儀檢測,左峰為未修飾的細胞(陰性對照),而右峰為錨定修飾的細胞(圖5)。結(jié)果顯示mIL-4-SA融合蛋白的錨定率為96.69%。

4 討 論

新型腫瘤疫苗是腫瘤生物治療研究的熱點,將具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子通過基因修飾或細胞表面錨定技術修飾腫瘤細胞制成疫苗是腫瘤疫苗研究的新策略。由于基因轉(zhuǎn)染存在轉(zhuǎn)移效率低以及病毒載體的潛在安全性問題,難以在臨床上廣泛應用。

圖5 mIL-4-SA對生物素化的B16F10細胞錨定的流式細胞檢測Fig.5 Modified rate of mIL-4-SA on biotinylated B16F10 cells by FACS

近年來,我們利用細胞膜表面易生物素化和生物素與SA高效而超強結(jié)合這兩個特性建立了細胞膜表面錨定修飾技術平臺,使具有免疫佐劑作用的細胞因子錨定在腫瘤細胞表面,以增強腫瘤疫苗誘導機體主動免疫的效果。我們研制的SA-GM-CSF融合蛋白對黑色素瘤細胞進行錨定修飾制成的腫瘤疫苗,獲得了良好的動物實驗效果[4]。

IL-4傳統(tǒng)上被認為是誘導體液勉疫應答的細胞因子。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外均有抗腫瘤作用,IL-4基因?qū)肽[瘤,可以降低其致瘤性,實驗證實應用IL-4轉(zhuǎn)染腫瘤細胞制備疫苗,可以導致腫瘤的縮小,這種作用通過天然免疫和特異性免疫應答實現(xiàn)[5-7],應用IL-4轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞,皮下預防接種,能夠有效抑制大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長,延長其生存期[8-9]。因此,IL-4在腫瘤的治療中有良好的前景。本文制備了mIL-4-SA融合蛋白,希望通過生物素和SA的結(jié)合,將IL-4直接錨定于生物素化的腫瘤細胞表面,制備腫瘤疫苗,以提高疫苗的抗腫瘤效應。目前,相關的動物實驗正在進行中。

本文成功構建了mIL-4-SA-pEt21的質(zhì)粒,在構建過程中,在IL-4和SA間引入甘氨酸、絲氨酸的連接肽(17肽),有助于融合蛋白中各單元蛋白質(zhì)分子的獨立折疊,從而保存各自的生物活性。設計中引入組氨酸標簽,利用二價陽離子與組氨酸結(jié)合的性質(zhì),用一步螯合色譜即可將表達的蛋白純度提高至95%,純化方法簡單、效率高。由于融合蛋白為包涵體表達,且IL-4中含有6個半胱氨酸,因此,復性成為難點。本文在復性過程中加入谷胱甘肽,精氨酸,有利于蛋白質(zhì)的正確折疊。實驗結(jié)果顯示,本文研制的mIL-4-SA融合蛋白具有雙功能活性,即能夠錨定于生物素化的腫瘤細胞表面,錨定率達96.69%,且同時具有IL-4的活性。在初步的動物實驗中顯示出高效的抗腫瘤功能。IL4-SA融合蛋白的研制有可能為腫瘤治療提供一種新的方法。

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