黃海波,陳味味,陳 偉,李 娟,李雪頔,劉群英

(江南大學(xué) 1.醫(yī)藥學(xué)院 生物制藥系;2.校醫(yī)院,江蘇 無(wú)錫 214122)

蟹類是我國(guó)市場(chǎng)上最常見(jiàn)的甲殼類水產(chǎn)食品,也是常見(jiàn)引起食源性過(guò)敏疾病的食物之一[1-2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和物質(zhì)生活水平的不斷提高,我國(guó)食源性過(guò)敏疾病的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì),因此,食物過(guò)敏已經(jīng)成為食品安全問(wèn)題之一[3]。本文以中華絨螯蟹過(guò)敏原蛋白提取物為診斷抗原,采用ELISA間接法檢測(cè)1907例人群血清中的特異性IgE,比較分析不同人群對(duì)蟹類食物的過(guò)敏反應(yīng)性,為蟹類食物過(guò)敏癥的臨床診斷與防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

1907例人群血清從江南大學(xué)校醫(yī)院收集,其中2008級(jí)本科入學(xué)新生1379例,2008級(jí)浙江大學(xué)遠(yuǎn)程學(xué)生158例,2008年本校職工體檢370例,樣品收集時(shí)間為2008年9月至11月。

1.2 試劑與儀器

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-羊抗人IgE為美國(guó)KPL公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白(BSA)、3′,3′,5′,5′,-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過(guò)氧化脲均為加拿大BBI公司產(chǎn)品;MK3型酶標(biāo)儀為美國(guó)熱電公司產(chǎn)品。

1.3 蟹過(guò)敏原蛋白提取物制備

取鮮活的中華絨螯蟹(購(gòu)自無(wú)錫水產(chǎn)品市場(chǎng))去除甲殼,挑取純凈肌肉組織用勻漿機(jī)勻漿后,按體積比1∶15的比例加入丙酮,置4℃冰箱脫脂,每天換液1次,期間攪拌2 h。48 h后濾去丙酮,干燥后稱重,每1 g樣品加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)15 mL,置4℃48 h,期間每天攪拌 2 h。4℃,12000 r/min離心20 min,收集上清,取樣測(cè)定蛋白濃度,其余置-35℃保存。

1.4 酶標(biāo)反應(yīng)板預(yù)包被與血清特異性IgE的檢測(cè)

酶標(biāo)反應(yīng)板預(yù)包被與封閉:蟹過(guò)敏原蛋白提取物用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)調(diào)整濃度至5 μ g/mL,包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板,50 μ L/孔(250 ng/孔),37 ℃孵育1 h,置4℃過(guò)夜,次日用PBS洗滌5次,加1%BSA封閉液220 μ L/孔,37 ℃孵育3 h,置4 ℃過(guò)夜,次日用PBS洗滌5次,密閉置4℃?zhèn)溆谩?/p>

血清特異性IgE檢測(cè):取待檢血清加入預(yù)包被的酶標(biāo)反應(yīng)板,50 μ L/孔;每塊反應(yīng)板設(shè)置空白孔,加入酶標(biāo)抗體稀釋液50 μ L/孔。置37℃溫箱孵育30 min,用PBS洗滌5次;加入1∶2000稀釋的HRP-羊抗人IgE,50 μ L/孔,37℃溫箱孵育 30 min,用PBS洗滌5次;加底物TMB和過(guò)氧化脲顯色15 min,1 mol/L硫酸終止反應(yīng),以空白孔調(diào)零測(cè)定A450值。

1.5 陽(yáng)性/陰性判定值(Cut off)的確定

從本院學(xué)生中選擇10例已知無(wú)任何食物和藥物過(guò)敏史的健康志愿者,采集血清樣品按1.4項(xiàng)下方法操作,測(cè)定 A450值,計(jì)算Cut off值。Cut off值=Σ A450/10×3。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 蟹過(guò)敏原蛋白提取物制備

經(jīng)脫脂處理和PBS提取得到的蟹過(guò)敏原蛋白溶液,蛋白濃度為4.3 mg/mL。

2.2 血清特異性IgE的檢測(cè)與分析

3組人群共1907例血清樣本的特異性IgE檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,不同人群組之間血清中蟹過(guò)敏原特異性IgE陽(yáng)性率有極顯著差異(χ2=121.29,P＜0.01)。組間分析表明,教職工組人群的血清特異性IgE陽(yáng)性率顯著高于兩組學(xué)生人群(教職工組與2008級(jí)學(xué)生組之間χ2=114.13、與浙大遠(yuǎn)程學(xué)生組之間χ2=27.65,P＜0.01),而兩組學(xué)生人群之間血清特異性 IgE陽(yáng)性率無(wú)差異(χ2=0.07,P＞0.05)。

表1 3組人群血清中蟹過(guò)敏原特異性IgE的檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The detection results of specific IgE to crab allergic protein in the sera from three group people

2.3 Cut off值的確定

根據(jù)10例志愿者血清特異性IgE測(cè)定的A450值(見(jiàn)表2),計(jì)算的Cut off值為0.159。

表2 10例健康志愿者血清特異性IgE檢測(cè)結(jié)果Tab.2 The results of specific IgE detection of the sera from healthy volunteer

3 討 論

近年來(lái),食品安全日益受到國(guó)內(nèi)外的廣泛重視。在食源性疾病中,因食物中的過(guò)敏原引起的過(guò)敏反應(yīng)是一大類常見(jiàn)的臨床疾病,對(duì)人們的身體健康和生命安全造成了很大的影響[4]。隨著食源性過(guò)敏疾病發(fā)病率的上升,食物過(guò)敏癥的診斷與防治成為我國(guó)醫(yī)藥科研的新內(nèi)容之一。

因進(jìn)食蟹類食品引起的超敏反應(yīng)疾病包括過(guò)敏性紫癜、蕁麻疹、過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性胃腸炎、過(guò)敏性鼻炎等。宋紅霞等[5]對(duì)120例過(guò)敏性紫癜患者分析特異性IgE結(jié)果表明,蛋白食物組過(guò)敏原以蝦/蟹陽(yáng)性率最高(15.8%),許等[6]也發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性紫癜患者中食入組過(guò)敏原陽(yáng)性率以蝦、蟹居首位。因進(jìn)食蟹類食物發(fā)生嚴(yán)重過(guò)敏者甚至發(fā)生過(guò)敏性休克[7]。

過(guò)敏性疾病的發(fā)生除了具有個(gè)體遺傳差異之外,還具有明顯的地域特點(diǎn),與患者的生活居住環(huán)境、變應(yīng)原物種、以及過(guò)敏原接觸史等密切相關(guān)。本文針對(duì)蟹類過(guò)敏原特異性IgE的檢測(cè)結(jié)果也顯示,不同人群中蟹過(guò)敏原特異性IgE的檢出率有顯著差異。3組人群中,江南大學(xué)學(xué)生來(lái)自除西藏、香港、澳門、臺(tái)灣以外的全國(guó)30個(gè)省市和自治區(qū),浙大遠(yuǎn)程學(xué)生主要來(lái)自江蘇省南部地區(qū)(無(wú)錫、宜興、江陰、鎮(zhèn)江、揚(yáng)州),而兩組學(xué)生人群之間血清特異性IgE陽(yáng)性率無(wú)差異(P＞0.05),表明蟹類食物過(guò)敏癥在國(guó)內(nèi)人群的地域特點(diǎn)不明顯;教職工生活居住在當(dāng)?shù)?但教職工人群血清的特異性IgE陽(yáng)性率顯著高于學(xué)生人群的陽(yáng)性率(P＜0.01)。筆者分析認(rèn)為,由于學(xué)生人群的飲食主要集中在食堂,而學(xué)生食堂一般極少提供價(jià)格較高的蟹類菜肴,因此學(xué)生人群接觸蟹類過(guò)敏原的機(jī)會(huì)相對(duì)較少;教職工主要為家居飲食而且條件較優(yōu)裕,接觸蟹類過(guò)敏原的機(jī)會(huì)相對(duì)較多。由此提示,蟹類食物過(guò)敏癥的發(fā)生主要與個(gè)體差異和人群的飲食條件密切相關(guān)。

目前,我國(guó)臨床上對(duì)各種過(guò)敏性疾病的實(shí)驗(yàn)診斷,主要采用過(guò)敏原體外檢測(cè)法和特異性IgE體外檢測(cè)法,使用的檢測(cè)試劑主要依賴進(jìn)口,如美國(guó)ASI公司生產(chǎn)的IVT過(guò)敏原體外檢測(cè)試劑盒[8]。鑒于變應(yīng)原物種的差異和過(guò)敏性疾病的地域特點(diǎn)等因素,有必要研究開(kāi)發(fā)適合我國(guó)地域特點(diǎn)和人群的過(guò)敏性疾病診斷試劑,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)試劑的國(guó)產(chǎn)化。本文結(jié)果表明,以蟹過(guò)敏原蛋白提取物為抗原檢測(cè)血清特異性IgE具有診斷意義,可為臨床蟹類食物過(guò)敏癥的診斷和防治提供實(shí)驗(yàn)診斷依據(jù)。

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