劉志禮 羅慶豐 黃山虎 周 揚 王 高 鄒平安 舒 勇

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的1種惡性程度很高的侵襲性疾病，雖然隨著化療藥物的發(fā)展，生存率有了較大的提高，但是行截肢及化療后仍有約40%患者死于腫瘤肺轉(zhuǎn)移［1］，根本原因是80% ～90%的患者在確診時全身微病灶轉(zhuǎn)移就已存在［2］，所以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移是影響腫瘤治療效果的重要因素，所以尋找1種參與腫瘤遠處侵襲及轉(zhuǎn)移的標記物為早期判斷腫瘤是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是非常重要。我們采用免疫組織化學染色的方法，檢測FASN和p97蛋白在骨肉瘤組織中的表達，以了解它們在骨肉瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移中的作用，為進一步研究其參與骨肉瘤遠處轉(zhuǎn)移提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標本來源與病例資料

選取南昌大學一附院、江西省腫瘤醫(yī)院、江西省人民醫(yī)院、浙江省余姚市人民醫(yī)院2002年至2009年經(jīng)手術(shù)切除的骨肉瘤組織標本60例:其中有肺轉(zhuǎn)移者13例，口腔轉(zhuǎn)移1例;男性34例，女性26例;年齡7～74歲，平均年齡18.4歲;骨母細胞型36例，纖維母細胞型15例，軟骨母細胞型9例;股骨遠端26例，脛骨近端16例，腓骨近端7例，肱骨近端7例，上頜骨2例，額骨2例。全部標本均經(jīng)臨床、影像學及病理組織學檢查確診為骨肉瘤。手術(shù)前所有病例均未經(jīng)放療及化療，術(shù)前均行腫瘤局部X線攝片、肺部CT、胸片、全身骨掃描等檢查。以21例骨軟骨瘤作為對照組。

1.2 方法

采用免疫組化SP法，兔抗FASN、p97多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，以已知陽性組織切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照，按1∶800稀釋;二抗兔/鼠雙標ChenMate TM EnVision HRP試劑盒購自Gene Company Limited;標本行免疫組化染色。常規(guī)脫蠟水化組織切片，組織抗原熱修復(fù)pH 6.0檸檬酸緩沖液，微波高檔20 min，10%山羊血清封閉，滴加一抗4℃過夜。滴加生物素標記的二抗室溫育45 min，滴加辣根酶標記的鏈霉素卵白素，室溫溫育45 min。各步驟之間以PBS沖洗，5 min連續(xù)3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片后在光鏡下觀察。

1.3 染色結(jié)果判定標準

FAS染色陽性表現(xiàn)為細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用半定量方法表達結(jié)果，將標本切片的染色強度和染色范圍分別記分后相加，所得的分數(shù)即為最后的評分。評分方法參照 Pizer［3］，染色強度，0分:染色為陰性;1分:染色為弱陽性(淺棕色);2分:染色為陽性(棕色);3分:染色為強陽性(深棕色)。染色范圍:0分為不顯色;1分為陽性細胞數(shù)＜10%;2分為陽性細胞數(shù)11% ～50%;3分為陽性細胞數(shù)51% ～80%;4分為陽性細胞數(shù)≥81%。病理切片染色結(jié)果判定，由兩名病理科醫(yī)師盲法獨立閱片完成，核對結(jié)果，取得共識。結(jié)果:①陰性表達:FAS評分＜4分為(－);②陽性表達:FAS評分≥4分;其中4分為(+)，5分為(++)，≥6分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包，對所得的數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，Spearman等級相關(guān)分析兩蛋白之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白的表達情況

FASN和p97蛋白染色陽性物彌漫分布于細胞質(zhì)中，呈深淺不一的棕黃色顆粒，p97蛋白在部分細胞核中亦有分布。在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中FASN陽性表達率分別為60.0%(36/60)和28.6%，(6/21)有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);p97蛋白在骨肉瘤與骨軟骨瘤中陽性表達率分別為68.3%(41/60)和8.1%(4/21)，有統(tǒng)計學差異(表1)。

2.2 骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白表達的相關(guān)性

骨肉瘤中FASN與p97蛋白表達程度的相關(guān)性分析，Spearman相關(guān)系數(shù) γ =0.7，P ＜0.01(表1)。

2.3 FASN和p97表達與骨肉瘤遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者中FASN和p97蛋白陽性表達率分別為85.7% 和 92.9%，明顯高于無遠處轉(zhuǎn)移骨肉瘤組織中 FASN(52.2%，24/46)和 p97(60.9%，28/46)陽性表達率，兩者差異有顯著意義(P＜0.05)，見表1。

2.4 FASN和p97表達與骨肉瘤病理組織學分型的關(guān)系

骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白表達與骨肉瘤病理組織學分型無關(guān)(表1)。

表1 FASN、p97表達及其與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討論

3.1 FASN與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展

20世紀80年代末，有學者發(fā)現(xiàn)某些乳腺癌組織能夠產(chǎn)生1種可與抗結(jié)合球蛋白抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)，稱之為結(jié)合球蛋白相關(guān)蛋白(Hpr)或癌源性抗原OA519，該抗原與較差的預(yù)后密切相關(guān)，經(jīng)過序列分析確定 Hpr就是脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)。Menendez等［4］研究表明FAS在腫瘤細胞中對細胞生存的作用遠遠大于在正常細胞中的作用，且FASN表達強度與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，是1種新的癌基因。FAS是內(nèi)源性脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，廣泛存在于動、植物組織細胞中，位于細胞胞質(zhì)內(nèi)，是1種大分子蛋白復(fù)合物，活性形式的FAS是以頭尾相對排列的二聚體形式，具有包括縮合、轉(zhuǎn)酰、還原、脫水在內(nèi)的7種酶活性，能夠催化丙二酰輔酶A、乙酰輔酶A和還原型輔酶Ⅱ體內(nèi)合成為長鏈(16碳)飽和軟脂酸鹽，參與細胞的能量供給等多種生物學功能。除了哺乳期的乳腺和周期性的子宮內(nèi)膜外，F(xiàn)AS在幾乎所有的正常組織中都只是低水平的表達。而腫瘤細胞的脂肪酸合成卻發(fā)生紊亂，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種組織來源的腫瘤細胞進行著過量的內(nèi)源性脂肪酸的生物合成，腫瘤細胞的生長依賴于內(nèi)源性的脂肪酸合成，從這些腫瘤組織中分離培養(yǎng)所得的細胞株也用內(nèi)源性的脂肪酸完成多項生物學功能。而且脂肪酸合成酶在82%的因患惡性腫瘤而死亡的患者腫瘤組織中過度表達且具有高活性，在培養(yǎng)的腫瘤細胞或異種移植動物模型中，F(xiàn)ASN的表達模式也與此相似［5］。FASN在腫瘤中的過度表達與磷脂酰肌醇23激酶/PTEN/AKt Kinase途徑有關(guān)［6］。FASN在多種惡性腫瘤細胞中存在高表達［7～11］，并且發(fā)現(xiàn) FASN 的高表達與膀胱、前列腺、乳腺等多種惡性腫瘤的組織分化及預(yù)后明顯相關(guān)［12，13］。我們在前期小樣本研究中［14～16］采用免疫組織化學法和Western Blotting方法，發(fā)現(xiàn)FASN在人骨肉瘤組織與細胞株U2-OS中高表達。在本研究中60骨肉瘤組織中FASN陽性表達率分別為60.0%(36/60)，而在骨軟骨瘤組織中陽性表達率只有28.6%(6/21)，有統(tǒng)計學差異;但是骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白表達與患者性別、年齡和WHO組織學分型無關(guān)。本研究中伴有骨肉瘤遠處轉(zhuǎn)移組FASN蛋白陽性表達率高達85.7%(12/14)，無遠處轉(zhuǎn)移組僅為 52.2%(24/46)，兩者差異有顯著意義，很可能FASN蛋白參與了骨肉瘤的遠處轉(zhuǎn)移，與文獻報道的結(jié)果相似［17］。

3.2 p97蛋白與腫瘤

p97蛋白是1種對于細胞生存必不可少的蛋白質(zhì)，在一些增生活躍的細胞中高度表達。它是ATP酶相關(guān)活性(AAA)超家族的成員，在細胞活動中主要起著分子伴侶的作用，參與膜的融合、轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)、細胞周期的調(diào)節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的降解及介導(dǎo)細胞黏附、凋亡等生理病理過程。有文獻報道［18～22］p97蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達，如食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌，并且參與腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。本研究中p97蛋白在骨肉瘤與骨軟骨瘤組織中陽性表達率分別為68.3%(41/60)和 8.1%(4/21)，統(tǒng)計學差異明顯，但是與骨肉瘤病理組織學類型無關(guān);在伴有骨肉瘤遠處轉(zhuǎn)移組中p97蛋白陽性表達率為92.9%，明顯高于無遠處轉(zhuǎn)移組(60.9%，28/46)，這也提示p97蛋白可能參與骨肉瘤的遠處轉(zhuǎn)移。

從本研究結(jié)果分析，F(xiàn)ASN與p97蛋白在骨肉瘤組織中呈高表達，推測這2種蛋白很可能參與了骨肉瘤的發(fā)生，Murata等［23］通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，使用藥物抑制FASN的表達和活性可以抑制直腸癌的肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率，說明FASN很可能參與了直腸癌的遠處轉(zhuǎn)移。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN與p97在骨肉瘤組織中表達呈顯著正相關(guān)，表明兩者在骨肉瘤的發(fā)生和進展中很可能存在一定程度的協(xié)同效應(yīng)，我們推測FASN和p97很可能參與了骨肉瘤的遠處轉(zhuǎn)移，可為骨肉瘤的基因及藥物治療的靶點。但是本研究因為轉(zhuǎn)移組的樣本量小，并且要說明某種蛋白是否參與腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移還需要通過大量的實驗來證實，本研究為進一步研究FASN和p97蛋白是否參與惡性腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移和機制提供理論依據(jù)。

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