蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院 郝向舉 李義＊ 王文娟 郭明凱 孫漢 王玥

益生菌具有調(diào)節(jié)動物腸道生態(tài)平衡，增進健康等重要作用，而芽孢桿菌在惡劣環(huán)境下形成的抗性休眠體芽孢具有耐高溫、耐擠壓、可經(jīng)受顆粒飼料加工過程中的惡劣環(huán)境，而在儲藏過程中，芽孢又不會消耗飼料的營養(yǎng)成分，不影響飼料品質(zhì)等優(yōu)點而倍受青睞。孢子體耐受酸堿，可避免消化液對它的破壞，從而順利進入宿主腸道。本試驗對河蟹腸道分離出一株對致病菌有體外抑制能力的地衣芽孢桿菌，對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并對其種子培養(yǎng)基進行探討，為河蟹益生菌制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種 地衣芽孢桿菌ESB3，分離自中華絨螯蟹腸道，本實驗室保存（李術(shù)娜等，2009）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)時間對菌株ESB3生長的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，初始pH為7.2的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，從第4小時開始，稀釋平板法測活菌數(shù)，每隔2 h檢測一次，直至48 h（王彥波，2009；羅璋等，2007；劉燕，2006；劉瑩等，2006）。

1.2.2 初始pH值對菌株ESB3生長的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有 50 mL， 初始 pH 分別為 6.3、6.6、6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、9.0 的肉湯培養(yǎng)液的 250 mL 三角瓶中，28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，在前一個試驗確定的最佳培養(yǎng)時間時測其OD600值，重復(fù)3次（王彥波，2009；于明超等，2007；周德慶，2002）。

1.2.3 溫度對菌株ESB3生長的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，前面試驗確定的最佳初始pH的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，150 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為 23、28、30、32、37 ℃和 42 ℃， 在第一個試驗確定的最佳培養(yǎng)時間時測其OD600值，重復(fù)3次 （李術(shù)娜等，2009；羅璋等，2007；劉燕，2006；劉瑩等，2006）。

1.2.4 鹽度對菌株ESB3生長的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，前面試驗確定的最佳初始pH的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)液其他成分不變，Na-Cl濃度（m/V）分別為 0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，150 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為前面試驗確定的生長最適溫度，在第一個試驗確定的最佳培養(yǎng)時間時測其OD600值，重復(fù)3次 （王彥波，2009）。

1.2.5 轉(zhuǎn)速對菌株ESB3生長的影響 取菌株ESB3培養(yǎng)24 h的肉湯培養(yǎng)液5 mL，接種于裝有50 mL，前面試驗確定的最佳初始pH、最佳鹽度的肉湯培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)溫度為前面試驗確定的生長最適溫度，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別為 130、150、170、190 r/min 和 210 r/min， 在第一個試驗確定的最佳培養(yǎng)時間時測其OD600值，重復(fù) 3 次（羅璋等，2007）。

1.2.6 不同碳源、氮源、無機鹽源對菌株ESB3生長的影響 選擇不同的碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉）添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使含量為1%（m/V）， 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 配 方 ：（NH4）2SO42.0 g，NaH2PO4·H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，蒸餾水 1000 mL；選擇不同的氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏和硝酸銨）添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使含量為1.5%（m/V）， 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：K2HPO41.36 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaH2PO42.13 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.5 g，蒸餾水1000 mL；選擇不同的無機鹽（NaCl、CaCl2、MgSO4、FeSO4和 K2HPO4） 替代牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的NaCl，使含量為0.5%（m/V）。三個單因子試驗培養(yǎng)條件均為前面試驗確定的最佳條件，在最佳培養(yǎng)時間時用稀釋平板計數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，重復(fù)3次 （劉瑩等，2006；羅璋等，2007；周德慶，2002；Qi等，2009）。

1.2.7 L9（34）正交試驗 以單因子試驗最適碳源的3個濃度1%、1.5%、2%（m/V）， 氮源的 3個濃度1%、2%、3%（m/V）， 無機鹽的 3個濃度0.3%、0.5%、0.7%（m/V）設(shè)計正交試驗。以單因子試驗確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)，稀釋平板計數(shù)各發(fā)酵液活菌數(shù)（劉瑩等，2006；羅璋等，2007；周德慶，2002；Qi等，2009）。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時間對菌株ESB3生長影響 結(jié)果見圖1。接種后6 h之前，細菌活菌數(shù)幾乎無變化，屬于生長曲線延滯期，從6～20 h細菌活菌數(shù)急劇上升，屬于生長曲線指數(shù)期，從20～36 h細菌活菌數(shù)波動很小，屬于生長穩(wěn)定期。36 h后細菌活菌數(shù)開始下降，屬于衰亡期。20 h為指數(shù)期和穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)折點，這個時間點上的培養(yǎng)物濃度高，子代培養(yǎng)物的延滯期也短，所以菌株ESB3的最佳發(fā)酵時間為20 h。

圖1 培養(yǎng)時間對菌株ESB3生長影響

2.1.2 初始pH值對地衣芽孢桿菌ESB3菌株生長的影響 結(jié)果見圖2。pH主要是影響菌體細胞膜電荷狀況，引起膜滲透性的變化以及影響營養(yǎng)物離子化程度，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收。pH 7.2、7.5、7.8 的 OD600值顯著高于 pH 8.1、9.0 （P ＜0.05），高于 pH 6.3、6.6、6.9，但差異不顯著（P ＞0.05），綜合顯著性差異分析，菌株ESB3生長最適pH為7.8。

圖2 初始pH值對菌株ESB3生長的影響

2.1.3 溫度對地衣芽孢桿菌ESB3生長的影響結(jié)果見圖3。溫度主要通過改變酶反應(yīng)速率來影響菌體的生長。一般培養(yǎng)基溫度升高，酶反應(yīng)速率增大，生長代謝加快，生產(chǎn)期提前。但酶本身很容易因過熱而失去活性，表現(xiàn)為菌體容易衰老，影響最終產(chǎn)量（Saarela等，2000）。本試驗中23～30℃時，地衣芽孢桿菌ESB3的生長隨溫度升高而上升，而30～42℃時，則隨溫度上升而下降。綜合顯著性差異分析，地衣芽孢桿菌ESB3的最適生長溫度為30℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對菌株ESB3生長的影響

2.1.4 鹽度對地衣芽孢桿菌ESB3生長的影響結(jié)果見圖4。無機鹽的營養(yǎng)功能十分重要，可以作為細胞內(nèi)一般分子成分，也可以調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定pH和作為酶的激活劑 （Verschuere等，2000）。NaCl是最常用的無機鹽。0%、0.5%、1%、1.5%、2%濃度組的OD600值無顯著差異 （P＞0.05），但2%的鹽度下OD600值已經(jīng)有下降的趨勢，而2.5%組 OD600值顯著變小（P＜0.05）。 這表示NaCl含量由0%～1.5%，鹽度變化對生長無明顯作用，而當大于1.5%時生長變緩。地衣芽孢桿菌ESB3的適宜培養(yǎng)鹽度為1.5%以下，最適鹽度為1.5%。這一結(jié)果與中華絨螯生活的環(huán)境情況相符。

圖4 鹽度對菌株ESB3生長的影響

2.1.5 轉(zhuǎn)速大小對地衣芽孢ESB3菌株生長的影響 結(jié)果見圖5。轉(zhuǎn)速在190 r/min時，OD600值顯著高于 130、150、210 r/min（P ＜ 0.05），好于 170 r/min，但差異不顯著（P＞0.05）。菌株ESB3的最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為190 r/min。

圖5 轉(zhuǎn)速對菌株ESB3生長的影響

2.2 最適種子培養(yǎng)基研究結(jié)果 不同碳源對ESB3生長的影響：結(jié)果見表1。以可溶性淀粉為碳源時，培養(yǎng)液活菌數(shù)最大為8.01×108CFU/mL，顯著高于其他組 （P＜0.05），組間極差為5.94×108。

表1 碳源、氮源、無機鹽選擇試驗結(jié)果×108CFU/mL

不同氮源對ESB3生長的影響：結(jié)果見表1。以胰蛋白胨為氮源時，培養(yǎng)液活菌數(shù)最大為10.03×108CFU/mL，顯著高于酵母膏和硝酸銨組（P＜0.05），好于蛋白胨和牛肉膏組，但差異不顯著（P ＞ 0.05），組間極差為 2.82×108。

不同無機鹽源對ESB3生長的影響：結(jié)果見表1。以K2HPO4為無機鹽源時，培養(yǎng)液活菌數(shù)最大為7.08×108CFU/mL。K2HPO4組顯著高于Mg-SO4、 FeSO4組（P ＜ 0.05），好于 NaCl、CaCl2組，但無顯著差異，組間極差為3.06×108。

L9（34）正交試驗：結(jié)果見表 2。 3 因素的極差大小為 K2HPO4（1.84）＞可溶性淀粉（1.64）＞胰蛋白胨（1.43）。極差越大，反映該因素水平變動時，總指標變化越大，也就是該指標對綜合指標的影響越大。本試驗條件下較好的因素搭配水平為可溶性淀粉（2%）、胰蛋白胨（2%）、K2HPO4（0.3%），此時培養(yǎng)液細菌濃度可達11.09×108CFU/mL。

表2 正交試驗結(jié)果×108CFU/mL

3 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌ESB3在本試驗條件下的最適發(fā)酵時間為20 h，生長的適宜初始pH為7.2～7.8，最適pH為7.8，最適生長溫度為30℃，適宜培養(yǎng)鹽度為1.5%以下，最適鹽度為1.5%，最適轉(zhuǎn)速為190 r/min。

單因子試驗表明，地衣芽孢桿菌ESB3在本試驗條件下的最適碳源、氮源和無機鹽分別為可溶性淀粉、胰蛋白胨和 K2HPO4。L9（34）正交試驗表明：可溶性淀粉（2%）（m/V）、胰蛋白胨（2%）（m/V）、K2HPO4（0.3%）（m/V）時地衣芽孢桿菌 ESB3活菌數(shù)最高，達 11.09×108CFU/mL。

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