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        轉(zhuǎn)基因大豆不同加工過程DNA降解研究

        2010-04-15 00:02:30葉可萍周光宏徐幸蓮祝長青
        食品科學 2010年13期
        關鍵詞:加工品外源轉(zhuǎn)基因

        葉可萍,周光宏,*,徐幸蓮,祝長青,2

        (1.南京農(nóng)業(yè)大學 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室,江蘇 南京 210095;2.江蘇出入境檢驗檢疫局,江蘇 南京 210001)

        轉(zhuǎn)基因大豆是目前種植面積最廣、產(chǎn)量最大的商品化種植轉(zhuǎn)基因作物。從1996年至2004年世界轉(zhuǎn)基因大豆種植面積從50萬hm2增至4840萬hm2[1-8],至2008年世界轉(zhuǎn)基因大豆種植面積達6580萬hm2,占所有轉(zhuǎn)基因作物面積的53%[9]。

        第一個大面積生產(chǎn)應用的轉(zhuǎn)基因大豆是抗除草劑草甘膦大豆(round-up ready soybean,RR大豆),由美國Monsanto(孟山都)公司1994年推出,并于1996年獲準推廣,成為最早獲準推廣的轉(zhuǎn)基因大豆品種[10]。其應用Ti質(zhì)粒介導轉(zhuǎn)移DNA(TV-DNA)轉(zhuǎn)移技術,將矮牽牛Ti質(zhì)粒的CaMV 35S啟動子控制EPSPS基因?qū)氪蠖?,進而培育成的具有抗除草劑草甘膦特性的轉(zhuǎn)基因大豆品種[11-12]。

        我國是世界上最大的轉(zhuǎn)基因大豆進口和消費大國,同時也是世界四大大豆主產(chǎn)國中唯一沒有批準商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因大豆的國家。從國內(nèi)大豆產(chǎn)量來看,2000年達到1530萬t,2005年達到1780萬t,2007年達到1550萬t,2008年為1750萬t,2008年比2000年增長14.3%,平均年遞增1.9%。從國內(nèi)大豆進口量來看,據(jù)海關統(tǒng)計,2000年約1024萬t,2005年約2659萬t,2007年為3082萬t,2008年達3700萬t,2008年比2000年增長261%[13]。從這些數(shù)據(jù)可看出,越來越多轉(zhuǎn)基因大豆進入我國市場,其加工品已廣泛地進入我國食物鏈。

        1 轉(zhuǎn)基因大豆及其加工品的食用安全性

        至今尚未發(fā)現(xiàn)食用轉(zhuǎn)基因大豆及加工品對人類健康有害的實例[14],但各領域?qū)ζ浒踩缘臓幷搹奈雌较ⅰarabara[15]發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因大豆含有一種類似雌性激素的化學物質(zhì),人類食用后會對人體荷爾蒙有一定影響,導致生殖器官異常,免疫系統(tǒng)發(fā)生障礙。Hardell等[16]認為如果轉(zhuǎn)基因大豆抗生素標記基因進入人體,可能轉(zhuǎn)移到有害致病菌中,使它們產(chǎn)生耐抗生素的能力,從而降低抗生素的臨床有效性,也可能使人體對很多抗生素產(chǎn)生抗性。菲律賓的兒童食品中含有轉(zhuǎn)基因大豆成分,部分嬰兒對其中一些新蛋白質(zhì)產(chǎn)生了不良反應。2002年7月英國食品標準局委托紐卡斯爾大學研究顯示,人類食用轉(zhuǎn)基因大豆制成的漢堡包和奶制品后,其腸道細菌內(nèi)仍帶有經(jīng)改造的基因[17]?!都~約時報》2001年8月17日報道,比利時科學家在RR轉(zhuǎn)基因大豆中發(fā)現(xiàn)一些來歷不明的未知DNA,其只出現(xiàn)在RR轉(zhuǎn)基因大豆中,位于人工插入的基因[10]。2004年意大利烏爾比諾大學學者實驗表明,轉(zhuǎn)基因大豆可改變小白鼠肝臟結構。葉增民等[18]認為我國進口轉(zhuǎn)基因大豆及加工品可能會在30年甚至更長時間后對人類健康等方面產(chǎn)生影響。

        2 轉(zhuǎn)基因大豆的優(yōu)勢及國內(nèi)加工趨向

        與國產(chǎn)大豆相比,進口轉(zhuǎn)基因大豆存在較大競爭力,對我國傳統(tǒng)大豆形成了巨大的沖擊。我國傳統(tǒng)大豆的競爭力相對較弱,主要表現(xiàn)在[19-20]:1)生產(chǎn)成本較大。轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)成本比傳統(tǒng)大豆低30%~35%,而產(chǎn)量卻高出15%~20%;2)流通費用過高。我國大豆生產(chǎn)主要集中在東北三省,而大豆需求主要在東南沿海地區(qū),如大型榨油廠一般都集中在我國南方沿海地區(qū);3)品質(zhì)較差。我國大豆出油率低,進口轉(zhuǎn)基因大豆的出油率在19%~20%,我國大豆出油率在16%~17%。同時我國大豆品質(zhì)的另一缺陷是專用性不強,目前我國培育的大豆品種是蛋白質(zhì)和高出油率混用品種,而國外培育的多是高蛋白質(zhì)或高含油率的專用品種。

        轉(zhuǎn)基因大豆大部分用于榨油,據(jù)估計我國80%~90%的大豆油是用轉(zhuǎn)基因大豆加工而成[18]。主要原因包括:1)安全性。油中轉(zhuǎn)基因成分微量,基因主要存在于大豆蛋白中,包括轉(zhuǎn)基因大豆普遍種植的美國也很少使用轉(zhuǎn)基因大豆直接加工成食品和大豆蛋白。我國2007年進口大豆3082萬t,100%用于榨油[13];2)利潤。由于轉(zhuǎn)基因大豆價格低廉、出油率高,利潤較高,對于油脂企業(yè)來說具有很大的誘惑;3)可利用性。轉(zhuǎn)基因大豆不僅可以作為油料資源,同時制油后的餅粕又是發(fā)展我國飼養(yǎng)業(yè)的優(yōu)質(zhì)蛋白資源。

        進口大豆幾乎全部是轉(zhuǎn)基因大豆,從食品安全考慮適宜用于榨制豆油,而國產(chǎn)大豆的主要用途不再是榨油,而是直接用于食品加工領域。可見國產(chǎn)大豆與進口大豆在加工用途上已經(jīng)明顯分化。

        3 不同加工過程對轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)、外源DNA降解的影響

        原料經(jīng)過若干道加工工序(如熱、壓力、酸堿和酶解等物理、化學或生物處理),理化性質(zhì)發(fā)生變化,使DNA產(chǎn)生一定的降解[21]。英國利茲(Leeds)大學研究表明,加工工藝可使某些轉(zhuǎn)入的外源DNA斷裂,當外源DNA片段小于單個基因大小時,物質(zhì)就不可能通過其遺傳而生存。因此,轉(zhuǎn)基因食物經(jīng)加工、烹調(diào)后,DNA的完整性、維持的時間及生物學活性值得關注。一個功能性的基因要想從轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到細菌中需要達到250bp以上[22]。因此,不僅要關心產(chǎn)品及副產(chǎn)品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分,而且也必須知道外源基因片段在加工過程中長度的變化規(guī)律。

        3.1 轉(zhuǎn)基因大豆加工品

        近幾年來國內(nèi)外一些學者開始研究不同加工環(huán)節(jié)內(nèi)外源基因的變化規(guī)律。對于一些傳統(tǒng)的豆制品,如豆腐、豆粉、豆奶等,主要是研究磨漿、煮漿等簡單的物理、化學加工過程。Bauer等[23]研究發(fā)現(xiàn)在豆奶和豆腐中可檢測到1339bp片段。對于轉(zhuǎn)基因大豆制成的豆奶和豆腐,生豆奶煮沸10min,基因片段從1714bp降到1339bp,而在豆腐中并未發(fā)現(xiàn)進一步的DNA降解。陳穎等[24]研究發(fā)現(xiàn)豆腐、豆奶、豆粉不同加工工藝對DNA的降解影響不同,終產(chǎn)品的DNA片段大小也不盡相同。物理過程如磨漿等能使大豆凝集素(Lectin)基因長度降解至原來的一半(約1000bp左右);高溫煮漿處理DNA片段并未受到破壞,但更高溫度及更長時間的殺菌使豆奶及豆粉中Lectin片段大小僅為400bp以下;蛋白質(zhì)變性過程同時也是DNA降解加劇的過程,豆腐的蛋白質(zhì)變性使Lectin片段從800bp降至200~400bp左右,這與Bauer結論有所不同。梁杉等[25]用高壓蒸氣處理豆粕,研究發(fā)現(xiàn)其對啟動子基因和終止子基因的影響明顯不同,啟動子基因均可檢測到246、165bp和101bp這3個處理后的片段,而終止子基因只能檢測到125bp片段,217bp片段在處理后檢測不到,這與陳穎等[26]報道相反。Peano等[27]研究了豆粉、薄脆餅干和豆腐中內(nèi)源大豆Lectin的降解情況,在豆粉中能夠檢測出1626bp的該基因片段,薄脆餅干和豆腐中只能分別檢測出391bp和169bp。梁克紅[28]研究豆粕進行干熱、濕熱、膨化處理后外源基因片段的降解情況。外源基因片段隨溫度的升高、加熱時間的延長,降解更嚴重,經(jīng)過120℃干熱10min后,降解到408bp以下;高壓對外源基因片段造成了嚴重的破壞,濕熱1min,外源基因降解到807bp以下;膨化處理對外源基因的影響不大,膨化以后外源基因降解到1512bp以下。Debode等[29]將轉(zhuǎn)基因大豆粉分別進行微波、加熱、超聲波破碎、高壓蒸汽處理,熒光定量PCR定量檢測內(nèi)源及外源成分發(fā)現(xiàn),物理處理導致Ct值(每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))的增加,即DNA含量減少。但最終的ΔCt值并沒有改變,即物理處理不會減少轉(zhuǎn)基因成分的相對含量,同時也發(fā)現(xiàn)物理處理很難使DNA降解到100bp以下。Murray等[30]也利用Real-time PCR定量檢測實驗室模擬豆腐加工過程中DNA的降解變化,對各加工工序點內(nèi)外源基因成分進行絕對定量。Yoshimura等[31-32]根據(jù)其實驗加工過程,設計不同引物擴增比較研究發(fā)現(xiàn),擴增RRS結構特異性基因101bp片段和121bp片段,與擴增的內(nèi)源基因Lectin長度(118bp)相似,最適合定量檢測轉(zhuǎn)基因大豆加工品。

        對于大豆蛋白、大豆油、醬油等大豆的深加工品,DNA降解程度較大,DNA最終降解到什么程度需更深入的認識,這對DNA高效提取及檢測技術靈敏度提出了更高的要求。Bauer等[23]研究大豆深加工蛋白質(zhì)D N A降解情況,發(fā)現(xiàn)其能擴增到7 1 4 b p片段。Vijayakumar等[33]模擬加工過程,通過加熱、高壓滅菌、微波等加工環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)基因成分的檢測,DNA的完整性、回收率和PCR擴增片段長度(<200bp)是影響轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的主要因素。轉(zhuǎn)基因大豆作為原料提取大豆油已成為現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因大豆主要用途之一。但大豆油中DNA含量較少,降解程度較大,使定性定量檢測產(chǎn)生一定困難。Grysona等[34]在實驗室模擬了大豆油的精煉過程,并且在大豆毛油中檢測到轉(zhuǎn)基因成分。Patrizia等[35]利用基于DNA的傳統(tǒng)方法和DNA生物傳感器能監(jiān)測轉(zhuǎn)基因大豆油加工鏈各個環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)基因成分情況。王小花[36]對大豆毛油精練成精煉油過程中的4道重要的工序進行采樣,用Taqman探針PCR檢測每個樣品的Lectin基因和CaMV 35S啟動子基因,建立了可靠的DNA提取技術和大豆油中轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法。

        轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)過加工后,DNA發(fā)生降解,在深加工品中外源成分基因片段長度甚至小于200bp,但降解到小于100bp的可能性很小,相關監(jiān)管部門可選擇合適的片段長短進行檢測。同時,不同加工過程中大豆DN A降解程度差別較大,因此對于轉(zhuǎn)基因成分的檢測,特別是定量檢測,可根據(jù)不同的加工品采用不同的方法。

        3.2 含有轉(zhuǎn)基因大豆成分的加工品

        國外已有轉(zhuǎn)基因大豆加工品進入到食物鏈中。如Fabio等[37]對巴西市場上含大豆蛋白質(zhì)的肉制品添加劑進行研究表明,在32個食品添加劑樣本中,25個樣本檢測到Lectin基因164bp片段,15個樣本中檢測到抗草甘膦大豆的特異基因169bp片段;在8種肉制品中檢測到Lectin基因,3種檢測到抗草甘膦大豆特異基因。Taski-Ajdukovic等[38]在塞爾維亞市場上銷售的51種肉制品中,發(fā)現(xiàn)其中12種可檢測到35S啟動子的195bp片段,并利用Real-time PCR對陽性品進行定量檢測。Cardarelli等[39]在檢測市場大豆產(chǎn)品及可能含有大豆成分的加工品中,6種香腸產(chǎn)品中2種存在RR大豆DNA成分。Greiner等[40]抽查的100個樣品中21%含有轉(zhuǎn)基因成分,其中3種大豆分離蛋白中就有一種檢測出含外源基因。Ujhelyi等[41]調(diào)查匈牙利市場21種肉制品,均檢測到Lectin基因,同時定量檢測外源基因發(fā)現(xiàn)其中5種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量大于5%,3種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量在0.9%~5%之間,4種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量小于0.1%。RR大豆的大豆蛋白已作為食品成分在加工肉制品中商業(yè)化應用,對肉制品的安全性提出了新的挑戰(zhàn)。因此有必要摸清轉(zhuǎn)基因大豆加工品中外源成分的情況,為其進入下游食物鏈的溯源追蹤做好準備。

        在轉(zhuǎn)基因大豆及其加工品進入食品市場后,許多國家已開始對轉(zhuǎn)基因食品進行標識和追溯。但轉(zhuǎn)基因大豆在加工過程中DNA會發(fā)生不同程度的降解,這對轉(zhuǎn)基因成分的檢測提出更高的要求。因此,了解大豆加工品中DNA的降解程度及其外源成分含量,以及不同加工工藝對DNA降解程度的影響,對轉(zhuǎn)基因加工品的檢測有重要的作用,能提供轉(zhuǎn)基因作物在我國食物鏈中加工及流通環(huán)節(jié)的相關信息,對于轉(zhuǎn)基因食品安全的檢測監(jiān)控及其追溯均有十分重要的意義。

        4 展 望

        轉(zhuǎn)基因大豆已進入食物鏈,其安全性越來越受到關注,不僅要考慮大豆及其加工品的轉(zhuǎn)基因成分,還要考慮其在加工過程中的變化以及基因組DNA降解后造成的影響,開展主要加工工藝對轉(zhuǎn)基因大豆DNA片段大小及含量的影響研究,全面研究轉(zhuǎn)基因大豆不同加工過程內(nèi)外源基因的變化情況。

        在加工過程中,轉(zhuǎn)基因大豆不同DNA片段降解程度不同,不同加工過程中轉(zhuǎn)基因大豆DNA降解程度也不同,國內(nèi)外學者的研究結果對此存在爭議,仍有必要進一步深入研究,這對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性定量檢測時根據(jù)不同加工品DNA片段的降解程度,設計大小適合的擴增引物具有非常重要的意義。

        隨著國產(chǎn)大豆的緊缺,轉(zhuǎn)基因大豆占據(jù)我國市場,國內(nèi)火腿腸生產(chǎn)企業(yè)不得不從美國、日本進口大豆及大豆粉,由于美國大豆主要是轉(zhuǎn)基因大豆,轉(zhuǎn)基因大豆很有可能進入到下游食物鏈中,食品受轉(zhuǎn)基因成分污染的可能性很大。因此,深入研究轉(zhuǎn)基因大豆加工過程DNA降解變化,確定轉(zhuǎn)基因大豆加工品中轉(zhuǎn)基因成分的含量及降解程度,根據(jù)加工過程每一個加工環(huán)節(jié)DNA情況,滿足食品加工鏈中溯源需要,并作為進行轉(zhuǎn)基因食品標識與追溯環(huán)節(jié)監(jiān)控的基礎工作。同時轉(zhuǎn)基因大豆加工品加工過程DNA降解情況的分析,為其進入食物鏈下游產(chǎn)品(如西式肉制品等)打好基礎,提供轉(zhuǎn)基因大豆成分在我國食品鏈中加工及流通環(huán)節(jié)的信息,為轉(zhuǎn)基因成分的標識與追溯提供依據(jù),確?!皬霓r(nóng)田到餐桌”全程將轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆加工品分開和標識。

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