童朝剛 陳曉鵬

染料示蹤法是淋巴結(jié)顯像的主要方法之一[1],染料的選擇是影響淋巴結(jié)顯像效率的重要因素之一，選擇理想的染料可進(jìn)一步提高淋巴結(jié)檢出率。國內(nèi)外常用的染料示蹤劑有亞甲藍(lán)、納米活性炭、中華墨汁等。本實(shí)驗(yàn)在建立鼠種植性胃癌模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用上述幾種常見染色顯像劑，探討它們在胃癌中的顯像效率并進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Walker-256腫瘤細(xì)胞株 由南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院提供。

1.1.2 動(dòng)物 健康SD雌性大白鼠40只,鼠齡6～8周,體重140～180 g,均由南京青龍山動(dòng)物繁殖場提供(批號：SCXK20060003)。

1.1.3 主要試劑 ①納米炭混懸注射液(商品名：卡納琳)，由重慶萊美藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20073246。②亞甲藍(lán)注射液，由江山濟(jì)川制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H32024827。③中華墨汁原墨,北京一得閣工貿(mào)中心生產(chǎn),小瓶分裝經(jīng)高溫高壓消毒后密封備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物胃腫瘤模型的制作方法 (1)鼠腫瘤性腹水模型的制作:將冷存的Walker-256細(xì)胞株復(fù)蘇后,取0.1～0.2 ml(含細(xì)胞約106個(gè))注入SD雌性大鼠腹腔內(nèi),清潔條件飼養(yǎng),5～7 天即可形成鼠腫瘤性腹水模型。然后抽取腹水約 2 ml注入另一只大鼠腹腔，約5 d即可再次形成傳代腹水模型。(2)鼠種植性胃腫瘤模型的制作:①從傳代的大鼠腹腔抽取癌性腹水5 ml,呈淡紅色洗肉水樣,鏡下可見大量瘤細(xì)胞。將抽取的腹水離心(1 000轉(zhuǎn)/分)5 min，離心完成后,棄去上層淡色較清亮的癌性腹水,保留下層較濃稠呈稀糊樣的半液態(tài)物，再以生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,即為腹水瘤細(xì)胞懸液，于冰塊上低溫放置備用。②36只SD大鼠以25%烏拉坦0.4 ml/100 g腹腔麻醉,仰臥位,四肢固定于手術(shù)臺(tái)上,腹部碘伏消毒取上腹正中切口，長1～1.5 cm，沿腹白線逐層進(jìn)腹,無菌紗布保護(hù)切口，暴露鼠胃前壁,于胃竇區(qū)前壁近小彎側(cè)漿膜下注入腫瘤細(xì)胞懸液約0.2 ml(勿刺破黏膜層)。拔針后,助手立即用棉簽按壓穿刺點(diǎn)2～5 min后,觀察沿針道無活動(dòng)性出血后,輕送胃還納腹腔,逐層關(guān)腹,鹽酸金霉素眼膏外涂防止感染。術(shù)后7天沿原切口進(jìn)腹觀測腫瘤的生長情況,并取少許腫瘤組織病理學(xué)檢查。

1.2.2 胃癌淋巴結(jié)的染色示蹤法 取36只腫瘤模型大鼠隨機(jī)進(jìn)入3組，即亞甲藍(lán)組、納米活性炭組、中華墨汁組。各組大鼠腹腔麻醉固定后，沿原切口進(jìn)腹，可見胃竇區(qū)小彎側(cè)結(jié)節(jié)型腫塊，直徑在0.5～1.0 cm不等，采用腫塊周圍4象限各注射1點(diǎn)的方法，每點(diǎn)染色劑注入量為0.1 ml，在5 s內(nèi)勻速注入。然后觀察各組染料到達(dá)第1、2站淋巴結(jié)的時(shí)間、淋巴結(jié)的檢出枚數(shù)及褪色時(shí)間。縫合切口,分別于術(shù)后1天、14天再次進(jìn)腹觀察各組淋巴結(jié)褪色情況。飼養(yǎng)2周后處死，切取肺臟、肝臟及腎臟送病理學(xué)檢查。各組動(dòng)物在注射前和飼養(yǎng)1周后,各抽取靜脈血檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和肌酐。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每個(gè)指標(biāo)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，每兩組間的比較采用Student-Newman-Keuls法，所有檢驗(yàn)的顯著性水平(α)取0.05雙側(cè),使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 染料在胃周淋巴系統(tǒng)中運(yùn)行的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

注入染料后，各種染色劑到達(dá)第1站淋巴結(jié)所用的平均時(shí)間，亞甲藍(lán)組為(14.33±2.22) s,納米活性炭組為(4.11±1.59)min、中華墨汁組為(20.00±8.53)min。染料運(yùn)行至第2站淋巴結(jié)的平均時(shí)間，亞甲藍(lán)組為(21.88±2.38) s,納米活性炭組為(13.75±4.61)min，中華墨汁組為>1 h。記錄數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知,不同染料間在到達(dá)1及第2站淋巴結(jié)時(shí)間上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，三者在顯像時(shí)間上差異明顯，亞甲藍(lán)組淋巴結(jié)較活性炭組顯像快(P<0.05)，但中華墨汁明顯長于前兩者。實(shí)驗(yàn)中，還觀察到2例淋巴結(jié)的跳躍性轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即第2、3站淋巴結(jié)先于第1站顯像。

2.2 染色淋巴結(jié)的檢出枚數(shù)

實(shí)驗(yàn)中，我們在注射染料示蹤劑后每隔10 min連續(xù)觀察1 h，必要時(shí)借助雙目手術(shù)顯微鏡記數(shù)顯像淋巴結(jié)的總枚數(shù)。各組檢出枚數(shù)亞甲藍(lán)組為 (7.83±1.75)枚,納米活性炭組為(7.25±1.77)枚,中華墨汁組為 (2.17±0.84)。組間比較：亞甲藍(lán)組與納米活性炭組間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.352)，即兩者在淋巴結(jié)顯像枚數(shù)無明顯差異；但中華墨汁在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)顯像淋巴結(jié)數(shù)明顯少于前兩者(P=0.00)。

2.3 染色淋巴結(jié)的褪色時(shí)間

實(shí)驗(yàn)中，我們每隔10 min肉眼觀察，以第1枚染色的淋巴結(jié)從著色到完全褪色的時(shí)間為褪色時(shí)間指標(biāo)。亞甲藍(lán)組淋巴結(jié)(102.08±10.74)min完全褪色，實(shí)驗(yàn)2 h內(nèi)，活性炭組及中華墨汁組第一枚染色淋巴結(jié)均未完全褪色。術(shù)后1天再次進(jìn)腹觀察，活性炭組首先染色淋巴結(jié)已完全褪色，而墨汁組仍黑染。對比注射部位,亞甲藍(lán)及活性炭組藍(lán)染組織在14天已明顯褪色,墨汁各組注射部位仍明顯黑染。

2.4 不良反應(yīng)

觀察期間各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均無明顯不良反應(yīng)發(fā)生,實(shí)驗(yàn)前后血液學(xué)肝腎功能主要指標(biāo)檢查無明顯變化，送檢的內(nèi)臟器官組織學(xué)檢查也未見明顯的病理學(xué)改變。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[2]利用Walker-256細(xì)胞株成功地復(fù)制出種植性胃腫瘤模型,此法具有制作簡便,重復(fù)性及穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)中之所以選用胃小彎側(cè)近胃竇旁為種植部位，因?yàn)榇颂幯汗?yīng)豐富，腫瘤細(xì)胞生長迅速，成瘤效率高,可為我們實(shí)驗(yàn)研究提供1種很好的胃腫瘤模型。

目前，淋巴結(jié)的示蹤法主要有染料法、核素法及兩者的聯(lián)合應(yīng)用[3]，其中染料法以其不需昂貴儀器、無放射性污染、操作簡單、易于被患者接受等優(yōu)點(diǎn)可能在我國(尤其在基層)更具有良好的推廣應(yīng)用前景。各種示蹤法在乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌已有廣泛應(yīng)用并日趨成熟[4，5]。但目前在胃癌中的應(yīng)用尚不多見，多在術(shù)前內(nèi)鏡下或術(shù)中注射染料[6]，以顯示淋巴回流示蹤淋巴結(jié)，指導(dǎo)淋巴結(jié)清掃。然而，染料的選擇可直接影響顯像的效率及淋巴結(jié)的清掃徹底性。常用的活性染料有亞甲藍(lán)、專利藍(lán)、墨汁、吲哚菁綠、微粒子活性炭等[1，7]。 好的活性染料示蹤劑應(yīng)具備:①淋巴組織吸收快,并能清楚顯示淋巴管和淋巴結(jié);②最好僅在淋巴結(jié)中聚積并停留較長的時(shí)間;③成本低、無毒性。幾種最常使用的染料中究竟那1種最符合以上條件尚有較大爭議,為之我們建立動(dòng)物模型,采用統(tǒng)一的研究方法對它們在胃癌淋巴結(jié)中的顯像效率進(jìn)行系統(tǒng)研究。

本實(shí)驗(yàn)顯示，注射亞甲藍(lán)后數(shù)分鐘內(nèi)，胃前、后壁及小彎側(cè)可見3～4條細(xì)小藍(lán)染淋巴管顯影,借助手術(shù)顯微鏡，甚至1 mm以下的淋巴結(jié)染色后都清晰可見，能滿意顯示胃癌周圍淋巴結(jié)分布情況,增加淋巴結(jié)檢出數(shù)目。根據(jù)染色情況及染色的先后順序,在實(shí)際中可為手術(shù)根治及淋巴清掃提供條件。這與亞甲藍(lán)的生物學(xué)特性有關(guān)[8]，其為水溶性色素，分子量小，滲透性強(qiáng)。局部注射后容易隨水和大分子進(jìn)入淋巴回流，從而顯示出注射部位的淋巴引流途徑。由于其良好的滲透性，淋巴結(jié)不論有無癌轉(zhuǎn)移，皆可使之著色，而活性炭對于有癌栓阻塞嚴(yán)重的淋巴結(jié)則難以顯色。此法的優(yōu)點(diǎn)是簡便易推廣且較為安全,藥品來源廣泛，價(jià)格便宜，無需特殊處理，即可使用，但實(shí)驗(yàn)顯示其仍存在著許多問題:染色快,色素消失也快，染色在1 h內(nèi)最明顯，必須在限定的時(shí)間內(nèi)觀察，故不適于術(shù)前內(nèi)鏡下染色及時(shí)間較長的手術(shù)。

納米碳混懸注射液(CH40)在日本全國范圍內(nèi)廣泛使用已逾十多年[9]，有大量臨床應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道，認(rèn)為有助于提高惡性腫瘤淋巴結(jié)清掃的數(shù)量，降低局部復(fù)發(fā)率，提高生存率，而沒有任何關(guān)于長期毒性的報(bào)道，國內(nèi)也有類似報(bào)道[10，11]。目前，卡納琳(商品名)為我國國內(nèi)唯一上市的納米碳混懸注射液，由重慶萊美藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，為活性炭經(jīng)納米技術(shù)處理，其團(tuán)粒微小、均勻，平均粒徑為150 nm，注射到腫瘤局部組織后，可被巨噬細(xì)胞吞噬，具有高度的淋巴系統(tǒng)趨向性。本組實(shí)驗(yàn)顯示，其同亞甲藍(lán)一樣可顯像淋巴結(jié)，但在到達(dá)第1、2站的時(shí)間及褪色時(shí)間上明顯長于前者，其染色程度更深。實(shí)際手術(shù)中，這些黑染淋巴結(jié)的存在可刺激外科醫(yī)生清掃更多的淋巴結(jié)，對重點(diǎn)部位進(jìn)行更精細(xì)徹底的清掃；還可以提供術(shù)者視覺上的提示，避免重要血管的損傷。所以，納米炭示蹤效果較理想，但是價(jià)格上千元，限制了其應(yīng)用。

我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到，中華墨汁擴(kuò)散速度較慢,局部黑染嚴(yán)重，淋巴結(jié)顯示效果差，因?yàn)橹腥A墨汁是由6%碳黑+85%水和一些穩(wěn)定劑制成的,碳顆粒的直徑0.1～6.0 μm，大小不均勻，以大顆粒為主，局部注射后很難進(jìn)入淋巴管，有些顆?？稍斐闪馨凸茏枞?，使局部黑染嚴(yán)重，故示蹤效果差。說明墨汁的染色效果明顯不如亞甲藍(lán)和活性炭。但國內(nèi)也見報(bào)道其可用于淋巴結(jié)的示蹤研究，這可能與其須調(diào)整至合適的濃度有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中，還可見顯像淋巴結(jié)多位于第1、2站，提示胃癌的淋巴回流多在第1、2站，與胃癌標(biāo)準(zhǔn)的D2根治術(shù)相吻合。但部分也可見第3站淋巴結(jié)顯像，甚至在顯像順序上先于1、2站，這可用來解釋胃淋巴引流通路錯(cuò)綜復(fù)雜,胃某一區(qū)域的淋巴回流并不一定按次序流經(jīng)某一淋巴結(jié),常出現(xiàn)跳躍轉(zhuǎn)移[12]。因此，顯像劑的應(yīng)用對發(fā)現(xiàn)胃癌異常解剖部位的“跳躍性”轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),指導(dǎo)胃癌手術(shù)切除范圍有重要意義。

綜上所述，亞甲藍(lán)和活性炭在胃癌的淋巴結(jié)顯像效率上相仿，可作為淋巴結(jié)的示蹤劑，指導(dǎo)術(shù)中淋巴結(jié)的清掃范圍，但兩者各具優(yōu)缺點(diǎn)，染、褪色時(shí)間上存在差異，提供給術(shù)者的時(shí)間活性炭要長于亞甲藍(lán)。中華墨汁的顯像效果不如前兩者。

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