陸 敏 王德明 王 焱 田耀洲 夏軍權(quán) 朱方石 王春如 滑永志(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化科,江蘇南京 210028)

胃黏膜腸上皮化生作為癌前病變,與胃癌發(fā)生有密切聯(lián)系,目前尚無療效滿意的治療藥物。本研究采用復(fù)方植物藥制劑——胃萎寧膠囊治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者40例,探討其對患者抑癌基因蛋白PTEN和p16表達的影響。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)備 Olympus H260型前視式高清晰電子胃鏡,CV-260型全數(shù)字電子內(nèi)鏡影像處理機,德國Zeiss公司Microm-340E型石蠟切片機,英國Shandon公司 Hypercenter-XP組織脫水機,英國Shandon公司 Histocentre-2型組織包埋機,HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)。

1.2 研究試劑 均為丹麥Dako公司產(chǎn)品。PTEN試劑:Mouse-Anti-Human,Clone:28H6,Code NO:GT201002。p16試劑:Mouse-Anti-Human,Clone:6H12,Code NO:GT201310。

1.3 研究藥物 胃萎寧膠囊,每粒0.4 g,由江蘇省現(xiàn)代中藥制劑工程技術(shù)研究中心提供,批號:蘇藥制字Z04000321。

1.4 研究對象 萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者共40例,其中男性28例,女性12例,年齡平均59.4±11.6歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)按2006年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會制定的《中國慢性胃炎共識意見》。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有研究對象知情同意。

1.5 研究方法

1.5.1 治療方法 萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者均口服胃萎寧膠囊,4粒,每日 3次(餐后),療程60 d。治療前后均行電子胃鏡及病理檢查。

1.5.2 腸上皮化生HE染色 胃黏膜活檢標(biāo)本均常規(guī)用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,HE染色并切片,依據(jù)固有腺體萎縮程度、黏膜肌層增厚、腸上皮化生、固有膜炎癥、淋巴濾泡形成來檢測。

1.5.3 免疫組化檢測 胃黏膜標(biāo)本共80個(40對)。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,PBS漂洗,浸泡于3%H 2 O2(20 min)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS(0.05 mmol?L-1,pH 7.4)洗 3次 ,每次5 min。組織切片置于10 mmol?L-1枸櫞酸鈉(pH 6.0)溶液,微波爐中沸騰 10 min,冷卻到室溫,用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗 3次,每次 5 min。滴加正常山羊血清封閉液,室溫 20 min。加入試劑,陰性對照用0.05 mmol?L-1PBS代替一抗。4℃過夜。用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗 3次,每次5 min。滴加生物素化二抗,20～37℃20 min,用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗3次 ,每次5 min。滴加試劑SABC,20～37 ℃20 min,用PBS(0.05 mmol?L-1,pH 7.4)洗 3次,每次5 min。8DAB顯色,蒸餾水洗終止反應(yīng)。

1.5.4 結(jié)果判斷 細胞漿內(nèi)見棕褐色顆粒染色為陽性。每個切片選5個高倍視野,按陽性細胞數(shù)占同類細胞總數(shù)的百分比來計算?！?%為陰性(-),6%～25%為表達陽性(+),26%～50%為表達顯著陽性(++),＞50%為表達強陽性(+++)。并以各細胞表達強度積分:(-)為0分、(+)為1分,(++)為2分,(+++)為3分。觀察染色情況,并進行各組染色強度積分統(tǒng)計。

1.5.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SAS 6.12軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用優(yōu)效性分析,治療前后療效等級比較采用Wilcoxon秩和檢驗。所有假設(shè)檢驗采用雙側(cè)檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者,口服胃萎寧膠囊治療后胃黏膜抑癌基因蛋白第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白的同源物基因(PTEN)的表達上調(diào)(P＜0.01);抑癌基因蛋白p16表達也上調(diào),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.564)(表1,圖1和圖2)。

表1 抑癌基因蛋白表達結(jié)果(n=40)

3 討 論

慢性萎縮性胃炎與胃癌發(fā)病關(guān)系密切,目前公認的模式為:慢性萎縮性胃炎→胃黏膜腸上皮化生→胃黏膜不典型增生(上皮內(nèi)瘤變)→胃癌。其過程與多基因改變有關(guān),包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活、原癌基因的擴增及癌基因產(chǎn)物的過度表達。

胃萎寧膠囊為國家名老中醫(yī)王德明所創(chuàng),以益氣健脾、行瘀化痰為治則,在臨床已應(yīng)用12年余,頗有良效,具有較完整的制作工藝和藥理學(xué)、毒理學(xué)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[1]。本研究采用胃萎寧膠囊治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生,并探討了其對抑癌基因蛋白PTEN與p16的作用。結(jié)果顯示治療前后患者胃黏膜抑癌基因蛋白PTEN的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而抑癌基因蛋白p16的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明胃萎寧膠囊作為植物藥復(fù)方制劑,其多途徑、多靶點效應(yīng)的本質(zhì),可能與其上調(diào)抑癌基因蛋白PTEN的表達相關(guān)。

PTEN基因是第1個被發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,已經(jīng)證實PTEN基因的表達水平與多數(shù)消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[2]。大量研究證據(jù)表明PTEN是一個強有力的抑癌基因,其突變頻率可以與p53相匹敵,這些特點使其成為p53之后最引人注目的一種抑癌基因。

PTEN基因的生物學(xué)功能主要包括以下兩個方面:(1)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡中的作用;(2)與細胞粘附、鋪展和遷移行為有關(guān)。細胞黏附力下降為腫瘤轉(zhuǎn)移前提之一,黏著斑(focaladhesion kinase,FAK)為整合蛋白信號分布于黏著斑復(fù)合物,FAK表達的增加和活化在細胞遷移中具有重要作用,而重組PTEN可使FAK體外脫磷酸化。Kang等[3]采用具甲基化特異性PCR檢驗了PTEN的甲基化狀況,在310例胃癌標(biāo)本中,62例(20%)免疫組化示PTEN表達缺失,這種改變與腫瘤的浸潤深度、大小、淋巴浸潤、進展期及患者的生存率有很大的關(guān)聯(lián)。

PTEN基因被稱為后p53時代突變最多的抑癌基因[4]。PTEN基因表達缺失可促進胃癌血管生成,并在胃癌的進展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,其表達在胃癌的發(fā)生、進展、生長、分化和血管生成中起重要作用。胃萎寧膠囊上調(diào)了抑癌基因蛋白PTEN的表達,促使腸上皮化生逆轉(zhuǎn),達到抑制胃癌發(fā)生的目的。

腸上皮化生的發(fā)病機制尚處于探索階段,幽門螺旋桿菌毒力因子、腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等均參與其發(fā)病環(huán)節(jié),單獨根除幽門螺旋桿菌似乎不足以逆轉(zhuǎn)腸上皮化生,聯(lián)合應(yīng)用其他化學(xué)阻斷劑以及中醫(yī)藥,可能是一條新的治療途徑。而且腸上皮化生和萎縮常呈灶狀分布,有限的幾點活檢標(biāo)本的代表性以及多次活檢的部位差異性等都可能對最后結(jié)果產(chǎn)生影響,幽門螺旋桿菌定標(biāo)活檢技術(shù)(marking targeting biopsy,MTB)的應(yīng)用可增加診斷及治療效果評價的準(zhǔn)確性[5]。

總之,胃萎寧膠囊治療萎縮性胃炎伴腸上皮化生有臨床療效,其機制可能與其調(diào)控抑癌基因蛋白PTEN的表達相關(guān)。但其有效成分復(fù)雜,對原癌基因的擴增及抑癌基因的作用還需進一步深入探討。

1 陸 敏,王德明,王春如,等.胃萎寧膠囊治療萎縮性胃炎伴腸上皮化生的臨床研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,14(9):21-23.

2 常曉華,姜愛民,張 超,等.大腸癌中Survivin、PTEN、p16的表達及其臨床意義[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2007,14(1):31-32.

3 Kang YH,Lee HS,Kim WH,et al.Promoter methy lation and silencing of PTEN in gastric carcinoma[J].Lab Invest,2002,82(3):285-291.

4 Park GS Jo YE,Kim HS,et al.Expression of PTEN and its correlation with angiogenesis in gastric carcinoma[J].Korean JGastroenterol,2005,46(3):196.

5 Si JM,Sun LM,Fang YJ,et al.Trial of a novel end oscopic tattooing biopsy forceps on animai model[J].World J Gastroenterol,2005,11(12):1859-1861.