樸松山 金鐵峰 金虎日

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科,吉林延吉 133000;2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理教研室,吉林延吉 133000;3.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科,吉林延吉 133000)

在我國,乳腺癌占全身各種惡性腫瘤的7%～10%;在女性其發(fā)病率僅次于子宮頸癌,并呈不斷增高的趨勢。曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)是鏈霉菌屬Hygropicus的產(chǎn)物,為有效的氧肟酸類組蛋白去乙?；?histonedeacetylases,HDACs)抑制劑,廣譜地抑制HDAC1,HDAC2,HDAC5和HDAC6的基因及蛋白表達。曲古抑菌素能使腫瘤與正常組織中的組蛋白乙?；?誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細胞分化或凋亡,還可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細胞中p21wafl的表達上升[1]。本文通過研究曲古抑菌素A對體外培養(yǎng)的人乳腺癌細胞系生長的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用,探討其抗腫瘤的作用機制,為臨床治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 曲古抑菌素A購自美國Sigma公司,乳腺癌MCF-7細胞株來源于美國ATCC(A-merica type culture collection)組織庫,p21鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德公司;ABC免疫組織細胞化學(xué)檢測試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。小牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1640培養(yǎng)基、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)等化學(xué)試劑購自北京華美公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將RPMI-1640培養(yǎng)基粉末10.4 g溶于 1 000 mL雙蒸水中,加入2 g NaHCO3,磁力攪拌至完全溶解,調(diào)整pH值至7.2。加入青霉素和鏈霉素使最終濃度各達到100 U。然后在每900 mL培養(yǎng)基中加入已滅活胎牛血清100 mL,經(jīng)過濾器過濾除菌,分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。另取少量培養(yǎng)液至培養(yǎng)皿中,置37℃培養(yǎng)箱中24～48 h,確定無污染后使用。復(fù)蘇MCF-7細胞株,穩(wěn)定傳代。

1.3 細胞增殖抑制實驗 用二甲氧唑黃比以法(XTT)(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)檢測細胞生存率。取狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞培養(yǎng)24～48 h,用0.25%胰蛋白酶液消化、制成單細胞懸液并在顯微鏡下進行細胞計數(shù),最終細胞懸液的濃度為 1×105?mL-1。取100μL細胞懸液加入96孔板的每1個孔,使每孔最終細胞數(shù)為1 000個,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天,應(yīng)用TSA工作稀釋液使終濃度分別達到 100、200、300、400 nmol?L-1。然后各取100μL的TSA稀釋液加入96孔板,每個濃度重復(fù)3次,每組設(shè) RPMI-1640空白對照組。置于37℃培養(yǎng)箱中加藥處理48 h后,取出培養(yǎng)板,在每孔加入新鮮配制的XTT液100μL,置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后上機檢測,用酶標儀在492 nm波長測定吸光值,并按公式計算細胞生存率:細胞生存率(%)=實驗組吸光值/對照組吸光值 ×100%。實驗重復(fù)3次,取平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 免疫細胞化學(xué)染色方法 將1×105?mL-1MCF-7細胞接種于裝有蓋玻片的 6孔板上,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,使細胞貼壁生長。實驗組用200 nmol?L-1丁酸鈉處理,對照組只加培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,棄去培養(yǎng)液,用PBS沖洗,用95%乙醇固定15 min,收集標本。免疫細胞化學(xué)染色方法根據(jù)ABC試劑盒說明書步驟進行。p21wafl鼠抗人單克隆抗體的稀釋比例均為1:50。具體步驟如下:(1)PBS沖洗5 min×3次;(2)分別加入100μL單抗工作液,4℃下過夜;(3)PBS沖洗 5 min×3次;(4)加入二抗(抗鼠IgG),室溫下孵育30 min;(5)PBS沖洗5 min×3次;(6)加顯色劑DAB工作液,顯微鏡下觀察至陽性顯色明顯時用自來水沖洗,終止顯色;(7)蘇木素復(fù)染1 min,自來水沖洗 10 min;(8)逐級脫水、透明,中性樹膠封片。

1.5 免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果判定 p21wafl以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性。采用雙評分半定量法進行蛋白表達評分:(1)靶細胞的陽性率＜25%為0分,25%～50%為1分,51%～75%為2分,＞75%為 3分;(2)染色反應(yīng)的深度記分為0～3分,根據(jù)染色深度以多數(shù)細胞的呈色反應(yīng)為準,不著色為0分,淺棕黃色為1分,棕黃色為2分,深棕黃色為3分。根據(jù)上述兩項的記分之和分為4級,即:陰性(-)為0分,弱陽性(+)為l～2分,陽性(++)為3～4分,強陽性(+++)為5～6分。每張涂片在高倍鏡下觀察10個視野,每個視野下分別計數(shù)陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)并計算陽性表達率。陽性表達率(%)=陽性細胞總數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,XTT數(shù)據(jù)處理采用方差分析,免疫細胞化學(xué)陽性表達率的行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度TSA對乳腺癌MCF-7細胞的抑制作用 當 TSA 濃度為 100、200、300、400 nmol?L-1時,對MCF-7細胞體外生長均有抑制作用,并呈明顯的劑量依賴關(guān)系。不同濃度與時間組之間比較有顯著性差異(P＜0.05),見表1。

2.2 MCF-7細胞的形態(tài)學(xué)改變 在倒置顯微鏡下觀察,TSA處理前的細胞(圖1A)呈三角形或多邊形,狀態(tài)良好;TSA處理12 h后的細胞(圖1B)明顯腫脹,拉長呈橢圓形。

2.3 TSA對MCF-7細胞p21wafl蛋白表達的影響

對照組(未經(jīng)TSA處理的)MCF-7細胞p21wafl蛋白的表達在24 h、48 h和72 h時均呈弱陽性(+),實驗組(經(jīng)TSA處理的)MCF-7細胞p21wafl蛋白的表達在24 h、48 h和72 h時呈強陽性(3+)。實驗組p21wafl蛋白的陽性表達率與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01),見表2和圖2。表明,TSA可上調(diào)p21wafL蛋白在乳腺癌癌細胞中的表達。

表1 不同濃度TSA(nmol?L-1)作用不同時間對 MCF-7細胞增殖生存率的影響(ˉx±s)

表 2 TSA對MCF-7細胞p21wafl蛋白表達的影響(ˉx±s)

3 討 論

惡性腫瘤的靶向治療近年來有了突破性進展[2],新的靶向治療藥物也不斷涌現(xiàn)。曲古抑菌素A(TSA)是一種氧肟酸類HDAC抑制劑,為一種抗真菌類藥物,能抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?這類HDAC抑制劑被證明在小劑量、低濃度情況下可導(dǎo)致腫瘤分化,并選擇性地抑制腫瘤生長而對正常細胞無毒副作用[3]。有研究[5]報道TSA對乳腺癌細胞MDA-MB-231的主要的殺傷作用是通過上調(diào)ERα和下調(diào)MMP-9來完成的。

本研究顯示在TSA的干預(yù)下,MCF-7細胞的生長受到了抑制。這種抑制呈時間和劑量依賴形式,即隨TSA作用時間的延長和藥物劑量的增大,細胞生長抑制程度逐漸增加。在本實驗中,將100 nmol?L-1的TSA作用于MCF-7細胞24h,就可以抑制癌細胞生長,提示TSA對人乳腺癌細胞系MCF-7的增殖具有很好的負調(diào)控作用,這為其在乳腺癌臨床化療中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

p21wafl基因是1993年底由 Harper等[4]發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因,它為單拷貝基因,定位于人染色體6p21.2上。p21wafl作為野生型p53基因的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,是細胞周期蛋白(cyclin)與細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)的廣泛抑制劑,可與多種cyclins/CDK復(fù)合物結(jié)合抑制底物磷酸化,導(dǎo)致G1期細胞生長阻滯,通過這一作用抑制細胞的無限增殖[5]。本實驗結(jié)果顯示p21wafl蛋白表達在對照組呈弱陽性,在實驗組呈強陽性。表明TSA可明顯上調(diào)p21wafl蛋白的表達,從而抑制乳腺癌細胞的增殖。

1 Boyault C,Sadoul K,Pabion M,et al.HDAC6,at the crossroads between cy toskeleton and cell signaling by acetylation and ubiquitination[J].Oncogene,2007,26(37):5468-5476.

2 Han ES,Lin P,Wakabayashi M.Current status on biologic therapies in the treatment of epithelial ovarian cancer[J].Cur r Treat Options Oncol,2009,Epub ahead of print.

3 Huang H,Zhang zX Xu YJ.et al.exp ression of p53,p21 in human lung adenoeareinoma A549 Cel Strains under Hypoxia conditions and the effect of TSA on their expression[J].Journal of Huazhong university of Science and Technology,2003,23(4):359-361.

4 Harper JW,Adami G R,Wei N,et al.The p21 Cdkinteracting protein Cipl is a potent inhibition of G1 cyclindependent kinases[J].Cell,1993,75:805-816.

5 Shapiro G I.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment[J].Clin Oncol,2006,24:1770-1783.