張士芳

（1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所 150040）

人及哺乳動物的精子在離開生殖道時，還不能立即與卵子受精，它必須經(jīng)歷一系列生理、生化及形態(tài)的變化才能獲得受精能力，這種生理現(xiàn)象稱之為獲能（capacitation）[1]。精子獲能是精子受精前必須經(jīng)歷的一個生理階段。自然情況下，精子獲能是在雌性生殖道內(nèi)進行，自宮頸開始，經(jīng)歷子宮和輸卵管，最后完成于輸卵管壺腹部[2]。研究表明，精子獲能不僅可以在雌性動物生殖道內(nèi)進行，也可以在體外適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行。

1 精子獲能的方法

精子獲能的方法分為體內(nèi)獲能和體外獲能兩種。

1.1 體內(nèi)獲能

早期的獲能研究，采用體內(nèi)獲能的方法，即從交配母畜的子宮內(nèi)取出精子用于受精，以受精率為指標，分析獲能的部位、時程及其機制[3]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，獲能過程沒有種的特異性，即精子不僅在同種生殖道內(nèi)，而且可以在異種動物生殖道內(nèi)或液體內(nèi)進行獲能。將牛精子放入家兔子宮和豬輸卵管內(nèi)培養(yǎng)同樣能使精子獲能[4]。精子在成熟過程中，表面被覆了蛋白質(zhì)類和多胺類，這些物質(zhì)的存在對獲能具有抑制作用。在體內(nèi)獲能期間，精子在雌性生殖道內(nèi)運動時，子宮頸黏液、輸卵管液和卵泡液，以及輸卵管上皮細胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促進獲能的發(fā)生。由于體內(nèi)獲能的研究，經(jīng)常受到許多條件的限制，在機體生殖道內(nèi)培養(yǎng)需時間，其環(huán)境也受卵巢激素影響，不穩(wěn)定因素多，且雌性生殖道內(nèi)，特別是輸卵管內(nèi)回收到的精子數(shù)量太少，測定獲能精子化學成分的改變更加困難；并且，精子在體內(nèi)總是與雌性生殖道分泌物接觸，而雌性生殖道中存在著影響獲能的因子，對于復雜的體內(nèi)環(huán)境人們又很難控制，因而給研究精子獲能帶來極大的困難。為此，體外獲能的研究方法應運而生[3]。

1.2 體外獲能

早期研究精子體外獲能通常使用各種動物的體液（如輸卵管液、濾泡液和血清等），而這些體液的成分相對復雜，很難確定何種成分誘發(fā)或支持精子獲能。自從Toyoda等最先報道了采用一種特定的化學培養(yǎng)基獲得體外受精成功以來，分析體外精子獲能已成為比較容易的事情[5]。以Tyrode、KRB、HamF10、BSA、BWW、BO等培養(yǎng)液進行哺乳動物精子獲能培養(yǎng)均見報道。目前，常用的為BO液和改良的Tyrdoe液（TALP）兩大類。許多哺乳動物，如鼠、牛、猴、馬等，其精子體外獲能的研究越來越多。近年來的研究表明，體外獲能發(fā)展起來的實驗手段幾乎可以達到與體內(nèi)獲能相同的效果，這就使得體外獲能的研究可以揭示體內(nèi)獲能的本質(zhì)[6]。精子體外獲能技術(shù)可以較好地控制實驗條件，并可逐個分析獲能的相關因子，極大地促進了精子獲能的研究。

精子體外獲能總體包括兩個步驟：一是精液的處理，目的是減少或去除精漿內(nèi)前列腺素、免疫活性細胞、細菌和碎片，減少精液的黏稠度，以促進精子獲能；二是使用某些特定成分誘導精子獲能和頂體反應[3]。目前，誘導精子體外獲能的方法主要有上浮法、沉淀加上游法和不連續(xù)密度梯度法。

經(jīng)上浮法處理可獲得活力較強的精子，但精子回收率較低，目前該方法已成為牛精子（尤其是凍精）洗滌與體外獲能的主要方法；精子沉淀加上游法適用于精子活力尚可或含有大量白細胞及碎片的精液，此方法有利于分離活動精子與死精子，且回收率較高；不連續(xù)密度梯度法是近年用于分離精子的良好方法，密度梯度離心法原理是形態(tài)正常精子的密度要高于異常的精子，經(jīng)平衡離心后得到高受精力的正常精子，該法適用于精子數(shù)量正常而活力較差的精液。若與精子上浮技術(shù)相結(jié)合，不連續(xù)密度梯度法可獲得更高質(zhì)量的精子[6]。

精子的質(zhì)量不同，獲能所使用的處理方法也不同，要根據(jù)精子的來源及質(zhì)量選擇相應的處理方法。江峰根據(jù)所使用人精液的質(zhì)量，將其處理方法分為7種：（l）少精子癥，離心后再重懸于較小體積營養(yǎng)液中；（2）弱精子癥，離心-上游技術(shù)結(jié)合添加咖啡因或血管舒緩素；（3）畸形精子，牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白或牛宮頸黏液濾過、Percoll密度梯度離心；（4）液化不全，玻璃纖維過濾；（5）黏度過高，淀粉酶處理、密度梯度離心等；（6）雜質(zhì)過多，上游法和Percoll密度梯度離心；（7）逆行射精，洗滌加上游處理[7]。

2 獲能評價的方法

精子獲能是一系列的生理生化反應過程，其步驟分為：（1）超激活運動 （hyperactivated motility，HAM）：精子鞭毛運動的頻率及類型發(fā)生改變；（2）獲能：精子膜結(jié)構(gòu)及特征的精細改變；（3）頂體反應（Arcosomal reaction，AR）：標志著精子獲能已經(jīng)完成。根據(jù)獲能精子在運動、形態(tài)及代謝等方面的變化特征，創(chuàng)立了多種精子獲能的評價方法。目前，常用的精子獲能評價方法為精子超激活運動、頂體反應和精子穿卵試驗（sperm penetration test，SPA）。此外還有去能因子鑒定法、測定精子呼吸能等方法。

2.1 超激活運動

精子一旦獲能，其運動類型即發(fā)生顯著改變，精子頭部側(cè)擺幅度和頻率明顯增加，尾部振幅加大，頻率加快，呈現(xiàn)一種特殊的超激活運動或鞭打樣運動。它是精子為適應受精而形成的一種特殊的運動類型，所反映的是精子運動能力和方式的改變。其特點是頭部運行軌跡呈不規(guī)律的“8”字形，并顯著地偏離直線。精子的超激活運動一般存在兩種運動類型：急劇地前向運動（或穿梭運動）和鞭打樣運動[3]。Yanagimachi于1970年首先在倉鼠精子獲能時觀察到這種現(xiàn)象。Wang等報道，人精子超激活運動的發(fā)生率與體外受精率呈高度相關性，并且對于精子穿越輸卵管峽部，克服輸卵管上皮細胞的阻力，最后穿過卵丘細胞及其細胞外基質(zhì)和透明帶起著重要的作用[8]。

目前，觀察精子超激活運動的應用技術(shù)有：顯微錄像技術(shù)、連續(xù)分步曝光技術(shù)和計算機輔助精子分析（CASA）技術(shù)等。CASA分析系統(tǒng)在臨床研究時備受青睞，它可達到客觀準確地量化精子運動情況，通過對精子頭部運動軌跡擺動圖形的分析，可獲得精子運動的多項參數(shù)，使人們對精子運動有更深層次的了解[9]。

2.2 頂體反應

頂體反應是精子在獲能過程中的生理變化和形態(tài)學變化，是哺乳動物的精子具備受精能力的必要條件。早期的研究者認為，頂體反應是由精子質(zhì)膜和頂體外膜相互融合，形成囊泡化，使頂體內(nèi)含物逸出頂體。陳大元等認為質(zhì)膜并不參與頂體囊泡化，而是雙層頂體外膜多位點自我融合而成[10]。雖然頂體反應是獲能的終點，但獲能過程本身還存在著不同階段，需要采用相應的判斷指標。隨著細胞生物學、分子生物學和免疫學以及顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，許多檢測精子頂體反應的技術(shù)相繼建立，如普通光鏡中的三色染色法（TST）和考馬斯亮藍染色法（CBB），電子顯微鏡檢查法（TEM）、熒光顯微技術(shù)中的金霉素熒光染色法（Chlortetracycline，CTC）、Hoechst33258 結(jié)合的植物凝集素標記法、頂體酶釋放測定法、單克隆抗體間接免疫熒光法和豌豆凝集素（FITC-PSA）標記法等[11]。

近年來，金霉素熒光染色法技術(shù)越來越受到人們的重視，它是根據(jù)精子不同獲能狀態(tài)進行染色，并可將精子分為3種CTC熒光染色類型，即F、B和AR型?！癋”型為未獲能精子，其頂體帽完整，整個頂體布滿黃綠色熒光；“B”型精子為已獲能精子，其特點是頂體帽仍然存在，但在頂體后區(qū)出現(xiàn)一條暗淡的熒光區(qū)帶；“AR”型精子，頂體帽缺，如整個精子頭部顯示淡綠色或無熒光，即為完成頂體反應的精子。目前此法已廣泛應用在小鼠、牛、豬、猴和狗等哺乳動物和人頂體反應機理研究中。并且Hewitt等將金霉素與活體熒光染料H33258對活精子進行雙色染色用于觀察整個體外受精獲能和頂體反應過程中頂體的變化[12]。

2.3 精子穿卵試驗

精子穿卵實驗是臨床上應用最廣泛的評價精子受精能力的重要方法。它不僅可提供精子獲能和頂體反應的狀況，而且還可以了解精子與卵膜的融合和精核的解聚能力。精子穿卵試驗最早由Yanagimachi等報道[13]，后經(jīng)過簡化、改良，并進一步標準化，使之適合于臨床應用[14，15]。穿卵試驗分為異種穿卵試驗和同種穿卵試驗。異種穿卵試驗主要利用倉鼠卵子和金黃地鼠卵子進行精子獲能鑒定。倉鼠卵異種精子體外穿透試驗，通過檢測經(jīng)各種方法處理后的復蘇凍精或鮮精精子的穿卵率，來評價精子的受精能力和體外獲能效果。而去除透明帶的金黃地鼠卵子對獲能精子沒有種間特異性，即能夠接受同種或異種動物獲能精子的穿入。將去除透明帶的金黃地鼠卵子與經(jīng)過獲能處理的精子一起孵育一段時間后，以有膨大的精子頭部或有雌雄原核并有精子尾部判斷為獲能精子穿入[15]。它為篩選避孕藥物和評價避孕藥物的效果及作用提供了新的方法。精子異種穿卵法在人、鼠、牛等動物精子受精能力的檢測中均取得了比較好的效果[16]。

2.4 其他方法

去能因子鑒定法和測定精子呼吸能法也是精子獲能的鑒定方法。

去能因子鑒定法是用T-HCl（Tetracycline）標記去能因子，獲能處理后，在顯微鏡下觀察，如果沒有熒光說明精子表面的去能因子已被除去，精子可能已獲能；如果還可以看見熒光，則精子還沒有獲能。由于熒光的易淬滅性，使得這一方法并不可靠。

測定精子呼吸能法所依據(jù)的原理是獲能精子比新鮮精子代謝能量要大。但是由于其操作繁瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，可信度不高，應用較少。

3 結(jié)語

精子獲能是受精的重要因素。自精子獲能被發(fā)現(xiàn)以來，對精子獲能的研究特別是體外獲能、獲能的評價等已經(jīng)取得了很大的進展。對精子獲能的變化，包括精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與生物化學特性發(fā)生系列改變，質(zhì)膜膽固醇含量減少，膜的離子滲透性增加，膜的超極化，胞內(nèi)pH升高，Ca2+和cAMP含量增加，超氧陰離子生成量增多，以及特異蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化增強等現(xiàn)象進行了研究。而由于精子獲能的分子機制相當復雜，且受到多種細胞信號途徑的調(diào)控，目前尚未明確，有待進一步研究。

[1] Austin CR.Observationson thePenetration oftheSperminto theMammalianEgg[J].SciResSerB，1951，4（4）:581-596.

[2] 石其賢，袁玉英.精子獲能及其發(fā)展[J].生理科學進展，1998，29（3）:243-245.

[3] 陳大元.受精生物學[M].北京:科學出版社，2000.

[4] H Imai，K Niwa ，A Iritani.Penetration in vitro ofzona-free hamstereggsbyejaculated boarspermatozoa[J].Reprod Fert，1977，51，495-497.

[5] ToyodaY，ChangM C.Capacitation ofepididymal spermatozoa with high K/Na ratio and cyclic AMP for the fertilization of rat eggs in vitro[J].Reprod Fert，1974，36，125-134.

[6] 薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京:科學出版社，2001.

[7] 江峰.精液體外處理方法的選擇 [J].中國男科學雜志，2000，14（2）:134-147.

[8] Wang C， Lee G S， Leung A，et al.Human sperm hyperactivationandacrosomereactionandtheirrelationships to human in vitro fertilization[J].Fertil Steril，1993 ，59（6）:1221-7.

[9] Davis R O，Katz D F.Standardization and comparability of CASAinstruments[J].Andrology，1992，13（1）:81-86.

[10] 陳大元，宋祥芬，段崇文，等.幾種哺乳動物精子頂體膜囊泡形成的研究[J].動物學報，1992，01，60-63.

[11] 江一平，卓丹心，陳勇，等.考馬斯亮藍染色法檢測人精子頂體反應的評價[J].解剖學報，1998，29（3）:332-336.

[12] Hewitt D A，England G C.An investigation of capacitation and the acrosome reaction in dog spermatozoa using a dual fluorescentstainingtechnique[J].AnimReprodSci.1998（5）29；51（4）:321-32.

[13] Yanagimachi R，Yanagimachi H，Rogers BJ.The use of zona-free animal ova as a test-system for the assessment of the fertilizing capacity of human spermatozoa[J].Biology of Reproduction.1976，15（4）:471-476.

[14] 顧一群.WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗檢驗手冊[M].北京:科學出版社，1992.

[15] 石其賢，鐘翠玲，袁玉英，等.精子穿卵試驗及其臨床應用[J].浙江醫(yī)學，1990，12（4）:204-207.

[16] 王琨，艾群.用精子異種穿卵方法檢測牛冷凍精液精子的質(zhì)量[J].中國奶牛，2000，（2）:32-33.