陳洪軒,陳倩倩,劉萬(wàn)路,史 榮,徐志杰

(1.河南大學(xué)藥物研究所,河南 開(kāi)封 475004;2.河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室;河南 開(kāi)封 475004)

白藜蘆醇乳脂體的制備和工藝考察

陳洪軒1,2,陳倩倩2,劉萬(wàn)路2,史 榮2,徐志杰2

(1.河南大學(xué)藥物研究所,河南 開(kāi)封 475004;2.河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室;河南 開(kāi)封 475004)

目的:采用薄膜分散法制備白藜蘆醇乳脂體,并對(duì)其進(jìn)行處方及工藝優(yōu)化。方法:以包封率為指標(biāo)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝。結(jié)果:制備白黎蘆醇乳脂體最佳處方為:磷脂與三硬脂酸甘油酯比例30∶1,磷脂與膽固醇比例10∶1,藥物與磷脂比例1∶25,磷脂與吐溫-80比例5∶1。最佳工藝為:水合時(shí)間90min,水合溫度35℃,水浴溫度45℃,超聲時(shí)間12min。結(jié)論:該處方工藝可行,所制備的白藜蘆醇乳脂體具有較高包封率。

白黎蘆醇;乳脂體;薄膜超聲分散法

乳脂體(Emulsome)[1]是近年來(lái)研究較多的一種新型藥物載體,由甘油三酯組成固體脂肪核,外周被一個(gè)或多個(gè)磷脂雙層包圍,因中心具有疏水核,類似普通的O/W乳劑,外周又被至少一層的磷脂層穩(wěn)定,類似脂質(zhì)體。它具有乳劑和脂質(zhì)體的特點(diǎn),能高濃度地將親脂性藥物包于中心疏水核中,還能將水溶性藥物包于磷脂層環(huán)繞的水性隔室中。乳脂體靜脈注射后主要在肝、脾、肺等組織器官中蓄積,從而提高藥物的治療指數(shù),減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性。

白藜蘆醇[2](Resveratrol,RES)又稱芪三酚,是含芪類結(jié)構(gòu)的二苯乙烯芪類、非黃酮類多酚物質(zhì),易溶于乙醚、氯仿等中,對(duì)光不穩(wěn)定。RES對(duì)心血管疾病有明顯的治療和預(yù)防作用,體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明它還能夠誘導(dǎo)大部分腫瘤細(xì)胞凋亡,具有抗腫瘤活性[3]。由于RES難溶于水,不易被吸收,給藥后體內(nèi)消除半衰期短,在血液中可較快地清除,而乳脂體可包封脂溶性藥物,所以本文將白藜蘆醇制成乳脂體,延長(zhǎng)其體內(nèi)作用時(shí)間,提高其生物利用度。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

高效液相色譜儀(SPD-6A紫外檢測(cè)器、LC-5A型高壓泵、7125進(jìn)樣閥20μL樣品管,Shimadzu LC-5A,Japan);J Y92-llN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有效公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);白藜蘆醇(鄭州荔諾生物科技有限公司,含量98%);注射用大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司,注射級(jí),批號(hào)030321);三硬脂酸甘油酯(上海汶水化工有限公司,化學(xué)純);其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白藜蘆醇乳質(zhì)體含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇∶水(80∶20);流速0.8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)306nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密秤取白藜蘆醇乳質(zhì)體標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg置于25mL容量瓶中,加甲醇適量超聲使標(biāo)準(zhǔn)品溶解,用甲醇定容至刻度,混勻,得0.1 g/L的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密取10mL儲(chǔ)備液,置于100mL容量瓶中,以甲醇定容至刻度,搖勻,得濃度為10mg/L的RES標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取RES標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 0.05、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL分別置于10mL容量瓶中,以甲醇定容至刻度,搖勻 ,得濃度分別為 0.05、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/L的系列溶液,分別進(jìn)樣20μL,以峰面積(A)為縱坐標(biāo)。以濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:

即RES在濃度0.05～25mg/L范圍內(nèi),峰面積與測(cè)定濃度曲線呈良好的線性關(guān)系,回收率高,重現(xiàn)性好,能準(zhǔn)確快速的進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2 包封率測(cè)定方法的建立

取已混勻RES乳脂體混懸液,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除去未包封的藥物,精密吸取續(xù)濾液0.2mL,于2mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,HPLC法測(cè)定濃度 (Ct)。另精密吸取已混勻的RES乳脂體混懸液0.2mL,與2mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,HPLC法測(cè)定濃度 (Ce),按如下公式計(jì)算包封率:

式中:Ce為乳脂體混懸液中總藥物濃度;Cf為游離藥物濃度;Ct為乳脂體中包裹的藥物濃度。

2.3 白藜蘆醇乳脂體制備方法的篩選

擬定初步處方,分別采用薄膜超聲分散法、逆相蒸發(fā)法和凍融法3種方法制備白藜蘆醇乳脂體,得到1～3號(hào)樣品溶液,分別用微孔濾膜過(guò)濾,參照2005年《中國(guó)藥典》中脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法,測(cè)定包封率,結(jié)果見(jiàn)表1。由上表可看出,薄膜超聲分散法的包封率較高。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜超聲分散法制備乳脂體。

表1 3種方法制得的RES乳脂體的包封率

2.4 處方工藝單因素考察

2.4.1 處方單因素考察

2.4.1.1 藥物與磷脂的比例對(duì)包封率的影響 考察了藥物與磷脂比例為 1∶05、1∶10、1∶15、1∶25、1∶50對(duì)包封率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。藥物與磷脂比例為1∶25時(shí),乳脂體的包封率較高。

圖1 藥物與磷脂的比例對(duì)包封率的影響

2.4.1.2 膽固醇與磷脂的比例對(duì)包封率的影響 考察了膽固醇與磷脂比例為 1∶02、1∶10、1∶15、1∶25、1∶30時(shí)的包封率,結(jié)果見(jiàn)圖2。膽固醇與磷脂比例為1∶10時(shí),乳脂體包封率較高。

圖2 膽固醇與磷脂的比例對(duì)包封率的影響

2.4.1.3 磷脂與三硬脂酸甘油酯的比例對(duì)包封率的影響 考察了磷脂與三硬脂酸甘油酯的比例1∶01、5∶01、15∶01、30∶01、60∶01時(shí)的包封率,結(jié)果見(jiàn)圖3。磷脂與三硬脂酸甘油酯比例為30∶01時(shí),乳脂體的包封率較高。

圖3 磷脂與三硬脂酸甘油酯的比例對(duì)包封率的影響

2.4.1.4 吐溫-80與磷脂的比例對(duì)包封率的影響測(cè)定了吐溫-80與磷脂比例分別為 0、1∶01、1∶05 、1∶10、1∶15時(shí)的包封率,結(jié)果見(jiàn)圖 4。吐溫-80與磷脂比例為1∶05時(shí),乳脂體包封率較高。

圖4 吐溫-80與磷脂的比例對(duì)包封率的影響

2.4.2 工藝因素考察

2.4.2.1 水合時(shí)間的選擇 分別測(cè)定了水合時(shí)間為0～200min時(shí)的包封率,結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)水合時(shí)間為90min時(shí),包封率較高。

圖5 水合時(shí)間對(duì)包封率的影響

2.4.2.2 水合溫度的選擇 測(cè)定了水合溫度為0～50℃時(shí)的包封率,結(jié)果見(jiàn)圖6。水合溫度為35℃時(shí),乳脂體包封率較高。

圖6 水合溫度對(duì)包封率的影響

2.4.2.3 水浴溫度的選擇 測(cè)定了0～70℃時(shí)的包封率,結(jié)果見(jiàn)圖7。45℃時(shí),脂質(zhì)體初步穩(wěn)定性較好,包封率高。

圖7 水浴溫度對(duì)包封率的影響

2.4.2.4 超聲時(shí)間的選擇 測(cè)定了超聲時(shí)間為0～25min時(shí)對(duì)包封率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖8。超聲時(shí)間延長(zhǎng),包封率增加,選擇超聲時(shí)間為12min。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響

2.4.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝 根據(jù)單因素考察,以RES與磷脂質(zhì)量比(A)、膽固醇與磷脂質(zhì)量比(B)、三硬脂酸甘油酯與磷脂質(zhì)量比(C)、Tween-80與磷脂質(zhì)量比(D)4個(gè)因素的不同水平考察對(duì)乳脂體包封率的影響(表2)。按L9(3＊4)安排試驗(yàn),測(cè)定各處方RES乳脂體的包封率,結(jié)果見(jiàn)表3。各因素的影響程度為B>A>C>D。膽固醇與磷脂的質(zhì)量比對(duì)RES乳脂體包封率的影響最大,吐溫-80和磷脂的質(zhì)量比影響最小。經(jīng)篩選得優(yōu)化組合為A1B3C1D2,即含藥量0.5 g/L,藥物與磷脂質(zhì)量比為1∶25,膽固醇與磷脂質(zhì)量比為1∶10,三硬脂酸甘油酯與磷脂質(zhì)量比為1∶30,吐溫-80與磷脂質(zhì)量比為1∶5。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 制備 采用最佳處方和制備工藝,稱取處方量的大豆卵磷脂、膽固醇、吐溫-80和白藜蘆醇溶于適量三氯甲烷,水浴超聲2min溶解,得到乳脂溶液。將該溶液置于圓底燒瓶中,于45℃恒溫水浴,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)60min蒸去三氯甲烷,使磷脂等成膜材料在瓶底部形成一均勻類脂膜。向圓底燒瓶中加10mL水合介質(zhì),35℃水合90min,進(jìn)行探頭超聲12min,得略透明乳脂體混懸液,即得。

3 討論

乳脂體有多種制備方法: 薄膜分散法、凍融法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法和乙醚注入法。由于三硬脂酸甘油酯不溶于乙醇和乙醚,后兩種方法不適合制備。本文對(duì)比了薄膜分散法、凍融法和逆相蒸發(fā)法3種方法,確定采用薄膜分散法,此法操作簡(jiǎn)便、包封率高、重現(xiàn)性好。

篩選出薄膜超聲分散法制備RES乳脂體,以包封率為考察指標(biāo),優(yōu)化了處方及制備工藝。在該法中,乳脂體制備的關(guān)鍵是形成均一的類脂薄膜,使被包裹藥物具有較高的包封率且不易從乳脂體中滲漏。

由于白藜蘆醇對(duì)光不穩(wěn)定,自然光照射條件下常溫放置24 h,含量下降26%,室溫棕色瓶放置24 h含量幾乎無(wú)變化,所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避光操作。

[1]Baur JA,Ainclair DA,Paul F.Therapeutic potential of resveratrol:the in vivo evidence[J].Nature Reviews Drug Discovery,2006,15(5):493-507.

[2]李延華,偉軍.白藜蘆醇的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].專論與綜述,2008,3(7):46-50.

[3]向敏,匡小東.白黎蘆醇及其藥理保健功能的研究[J].中國(guó)食品添加劑,2004,28(5):16-20.

[責(zé)任編輯 姬 荷]

Preparation and process study of resveratrol emulsomes

CHEN Hong-xuan1,2,CHEN Qian-qian2,LIU Wan-lu2,SHI Rong2,XU Zhi-jie2(1.Institute of Chinese Meteria Medica of Henan University, Kaif eng, Henan 475004,China;2.Pharmaceutical College ofHenan University,Kaif eng,Henan475004,China)

Objective:To prepare resveratrol emulsome with thin film sonication method and to optimize its process.Methods:The entrapment efficiency of formulation and process factors were investigated,and the orthogonal optimization formulation was designed.Results:The better prescription for the preparation of resveratrol emulsome was the ratio of phospholipids and three stearic acid glyceride was 30∶1;the ratio of phospholipid and cholesterol was 10∶1;the ratio of phospholipids and drug was 25∶1;the ratio of phospholipids and the ratio of Tween-80 was 5∶1;the better process was as follows:the hydration time:90min;hydration temperature:35 ℃;water temperature:45 ℃;ultrasonic time:12min.Conclusion:The formulation technology is feasible,and the encapsulation efficiency of resveratrol emulsomes is high.

resveratrol;emulsome;thin film sonication

TQ460.6

A

1672-7606(2010)04-0266-04

2010-10-19

陳洪軒(1952-),男,河南杞縣人,碩士生導(dǎo)師,副教授,從事現(xiàn)代給藥系統(tǒng)和制劑新技術(shù)研究。